白 靜 馬雪娜 陳舒婷 周子娟 王福金 王愛國 王靖宇

(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，大連 116044)

王愛國(1970—)，男，教授，研究方向：分子遺傳學(xué).E-mail:wangaiguotl@hotmail.com

犬髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(Canine Hip Dysplasia，CHD)是一種受多基因調(diào)控的先天性遺傳疾病，多見于大型或特大型犬，如拉布拉多犬、金毛尋回獵犬等?；加蠧HD的犬因關(guān)節(jié)磨損疼痛而行走困難[1-2]。CHD不能通過藥物治療痊愈，臨床手術(shù)是唯一有效的治療途徑[1]。但這方面的醫(yī)療資源緊缺，手術(shù)費(fèi)用昂貴。因而在育種時期對CHD犬的篩選尤為重要，不僅可減少疼痛犬，也可節(jié)省大量的社會資源。其中，采用遺傳學(xué)基因診斷的方法淘汰具有CHD傾向的繁育犬，是有效避免出現(xiàn)CHD犬的理想方法。

髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的成因尚不明確，目前認(rèn)為有兩種主要原因：關(guān)節(jié)松弛(包括韌帶、肌肉、關(guān)節(jié)囊)和軟骨內(nèi)成骨障礙，或者這兩個過程的綜合作用[2-3]。COL6A3基因與FN1基因分別參與了肌肉組織、軟骨基質(zhì)的組成[4-5]，特別是，有報(bào)道稱COL6A3基因的2個SNP位點(diǎn)(CFA25：51031100，51040259)和FN1基因的1個SNP位點(diǎn)(CFA37：25095511)與CHD顯著相關(guān)[3, 6-7]。但這兩個基因的SNP位點(diǎn)能否成為有效預(yù)測髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的實(shí)用性遺傳學(xué)診斷指標(biāo)，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

培育成本高和培訓(xùn)成功率低是導(dǎo)盲犬事業(yè)目前面臨的兩大難題[8-9]，犬只的淘汰主要包括性情和健康兩方面原因，而CHD是健康原因中的首要因素。因而篩除有CHD患病傾向的犬對提高導(dǎo)盲犬的培訓(xùn)成功率、降低導(dǎo)盲犬的培育成本具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過對與CHD顯著相關(guān)的COL6A3和FN1基因上的3個SNP位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測，驗(yàn)證其能否成為CHD的實(shí)用性遺傳學(xué)診斷指標(biāo)，以期為導(dǎo)盲犬的選育提供有效的篩選方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(X光片診斷)的拉布拉多犬8只、金毛尋回獵犬5只；健康的拉布拉多犬23只、金毛尋回獵犬7只。部分犬(8只)為全國范圍內(nèi)募集所得，其余犬(37只)均由中國導(dǎo)盲犬大連培訓(xùn)基地提供。

1.1.2主要試劑與儀器：EDTA-K2真空采血管，購于江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司；Blood Extraction Kit試劑盒，購于寶生物(大連)生物技術(shù)有限公司；主要儀器包括動物X光機(jī)(AVChoice 400，代爾公司)，PCR儀(美國Thermo公司)；電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；Gel DocTM EZ成像儀(Bio RAD公司)等。

1.2 方法

1.2.1影像學(xué)診斷：采用動物X光機(jī)對犬的髖關(guān)節(jié)進(jìn)行影像學(xué)診斷，髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的發(fā)病程度采用 Norberg 角來度量，方法為在一張標(biāo)準(zhǔn)的OFA(Orthopedic Foundation for Animal)片子上，在兩股骨頭中心作一連線，再由股骨頭中心向髖臼前側(cè)緣作直線，這兩線夾角為 Norberg 角，Norberg 角的范圍一般在 50°～120°之間，大于等于105°被認(rèn)定為健康犬(圖1A所示)，股骨頭沒有脫節(jié)但Norberg角小于等于90°(圖1B所示)或股骨頭完全脫出髖臼(圖1C所示)被認(rèn)定為重度CHD。

圖1 犬髖關(guān)節(jié)X光影像圖注：A：健康犬;B、C：重度髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬Fig.1 X ray image of the dog hip jointNote：A: normal;B、C: CHD

1.2.2基因組DNA的提取：從犬的前肢靜脈采血3～5 mL，置于含EDTA抗凝劑的真空采血管中。采用Blood Extraction Kit試劑盒提取血細(xì)胞中的基因組DNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3引物設(shè)計(jì)：依據(jù)文獻(xiàn)中已報(bào)的與犬髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良相關(guān)的COL6A3和FN1基因的3個SNP位點(diǎn)[3, 6]，在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行基因位點(diǎn)確認(rèn)，以SNP位點(diǎn)為中心選取DNA序列，應(yīng)用Primer 3.0軟件(http://primer3.ut.ee/)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并對設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證和條件優(yōu)化?；虻腟NP位點(diǎn)信息及引物序列詳見表1。

表1 COL6A3和FN1基因SNP位點(diǎn)的生物學(xué)信息及引物序列Table 1 The bioinformation and primer sequencesof SNPs of COL6A3 and FN1 genes

1.2.4測序及SNP位點(diǎn)分型：DNA樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后，委托寶生物(大連)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。通過對測序數(shù)據(jù)的分析，確認(rèn)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性類型(圖2)。

圖2 COL6A3及FN1基因的SNP位點(diǎn)的測序檢測注;A、B、C為COL6A3CFA25∶51040259 SNP位點(diǎn)上的A/A型，A/G型，G/G型；D、E、F為COL6A3CFA25∶51031100 SNP位點(diǎn)上的A/A型，A/G型，G/G型；G、H、I為FN1 CFA37∶25095511 SNP位點(diǎn)上的A/A型，A/T型，T/T型。Fig.2 SNP loci of COL6A3 and FN1analyzed by DNA sequencingNote: A, B, C: COL6A3 CFA25∶51040259 SNP loci; D, E, F: COL6A3 CFA25∶51031100SNP loci;G, H, I: FN1CFA37∶25095511 SNP loci

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對基因的SNP位點(diǎn)多態(tài)性與髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，P<0.05為顯著相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 COL6A3基因的CFA25：51040259 SNP位點(diǎn)的多態(tài)性檢測及分析

以13只髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬與30只健康犬為研究對象，對COL6A3基因的CFA25∶51040259位點(diǎn)進(jìn)行PCR、測序和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表2所示：A/A、A/G、G/G型在健康犬和髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬中所占比例均沒有顯著差異(P>0.05)。

表2 COL6A3基因的CFA25∶51040259SNP位點(diǎn)的檢測及分析Table 2 The detection and analysis ofCOL6A3 CFA25∶51040259 SNP loci

2.2 拉布拉多犬中COL6A3基因的CFA25：51040259 SNP位點(diǎn)的檢測及分析

以8只髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的拉布拉多犬與23只健康的拉布拉多犬為研究對象，對COL6A3基因的CFA25：51040259位點(diǎn)進(jìn)行PCR、測序和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表3所示：A/A、A/G、G/G型在健康拉布拉多犬和髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的拉布拉多犬中所占比例均沒有顯著差異(P>0.05)。但A/A型所占比例呈現(xiàn)出有差異的趨勢(P=0.07)。

表3 拉布拉多犬中COL6A3基因的CFA25∶51040259 SNP位點(diǎn)的檢測及分析Table 3 The detection and analysis of COL6A3 CFA25∶51040259 SNP loci in the Labrador retriever

2.3 金毛尋回犬中COL6A3基因的CFA25：51040259 SNP位點(diǎn)的檢測及分析

以5只髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的金毛尋回獵犬與7只健康的金毛尋回獵犬為研究對象，對COL6A3基因的CFA25：51040259位點(diǎn)進(jìn)行PCR、測序和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表4所示：A/A、A/G、G/G型在健康的金毛尋回獵犬和髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的金毛尋回獵犬中所占比例均沒有顯著差異(P>0.05)。但G/G型在髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的金毛尋回獵犬中有占主要基因型的趨勢(P=0.1)。

表4 金毛尋回獵犬中COL6A3基因的CFA25：51040259SNP位點(diǎn)的檢測及分析Table 4 The detection and analysis of COL6A3 CFA25：51040259 SNP loci in the Golden retriever

2.4 COL6A3基因的CFA25：51031100 SNP位點(diǎn)的多態(tài)性檢測及分析

以14只髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬與中國導(dǎo)盲犬大連培訓(xùn)基地的21只健康犬為研究對象，對COL6A3基因的CFA25：51031100位點(diǎn)進(jìn)行PCR、測序和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表5所示：A/A、A/G、G/G型在健康犬和髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬中所占比例均沒有顯著差異(P>0.05)。

表5 COL6A3基因的CFA25：51031100SNP位點(diǎn)的檢測及分析Table 5 The detection and analysis of COL6A3 CFA25：51031100 SNP loci

2.5 FN1基因的CFA37：25095511 SNP位點(diǎn)的多態(tài)性檢測及分析

以12只髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬與30只健康犬為研究對象，對 FN1基因的CFA37：25095511位點(diǎn)進(jìn)行PCR、測序和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表6所示：A/A、T/A、T/T型在健康犬和髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬中所占比例均沒有顯著差異(P>0.05)。

表6 FN1基因的CFA37：25095511SNP位點(diǎn)的檢測及分析Table 6 The detection and analysis of FN1CFA37：25095511 SNP loci

3 討論

CHD是一種受多基因調(diào)控、性狀復(fù)雜并和多個染色體區(qū)域相關(guān)聯(lián)的障礙疾病，其遺傳方式尚不明確。目前研究表明，可能有2種遺傳體系影響CHD的發(fā)生，一是控制髖關(guān)節(jié)周圍關(guān)節(jié)囊松弛的基因，二是控制髖臼發(fā)育不良的多基因系統(tǒng)，或兩者的單獨(dú)或協(xié)同作用[10]。其中髖關(guān)節(jié)松弛具有較高的遺傳率[11]，已有研究表明，COL6A3與FN1基因均與髖關(guān)節(jié)松弛相關(guān)[3, 6-7]。

COL6A3基因編碼膠原蛋白VI中的α3鏈，如發(fā)生純合突變將導(dǎo)致膠原蛋白VI的減少，而膠原蛋白是軟骨細(xì)胞、軟骨纖維的主要成分，與關(guān)節(jié)松弛密切相關(guān)[4]。有研究報(bào)道其SNP位點(diǎn)(CFA25∶51040259)的A/A型在正常和髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的拉布拉多犬的比例有極顯著性差異[12]。但我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，COL6A3基因的SNP位點(diǎn)CFA25∶51040259及CFA25∶51031100的三種基因型(A/A、A/G、G/G)在健康犬和髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬中所占比例均沒有顯著差異(表2，表5)。由于本研究的對象包括拉布拉多犬與金毛尋回獵犬，考慮到可能存在的不同品種犬之間的遺傳差異，我們又分別對這兩種犬的測序結(jié)果進(jìn)行了單獨(dú)分析。結(jié)果表明，拉布拉多犬與金毛尋回獵犬中患CHD犬的COL6A3基因SNP位點(diǎn)(CFA25∶51040259)的基因型趨向不同，拉布拉多犬趨向于A/A型，而金毛尋回獵犬趨向于G/G型，但并無顯著差異(表3，表4)。雖然本研究的樣本量相對較少，但也充分說明COL6A3基因的SNP位點(diǎn)CFA25∶51040259及CFA25∶51031100不能作為CHD實(shí)用性的診斷指標(biāo)。

FN1基因與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的組分以及軟骨基質(zhì)組織的功能密切相關(guān)[5]。有報(bào)道表明FN1基因的SNP位點(diǎn)CFA37∶25095511與伯恩山犬、德國牧羊犬的CHD疾病顯著相關(guān)[6-7]。但本研究結(jié)果表明，F(xiàn)N1基因的該SNP位點(diǎn)基因型在健康犬和髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬中的比例沒有顯著差異(表6)，并且在拉布拉多犬與金毛尋回獵犬犬種內(nèi)部的獨(dú)立分析也不存在顯著差異，說明該SNP位點(diǎn)不能作為CHD實(shí)用性的診斷指標(biāo)。

本次研究沒有檢測出差異的原因主要有以下幾點(diǎn)：第一，CHD的致病原因和遺傳體系尚未明確，關(guān)節(jié)松弛與CHD發(fā)生的具體聯(lián)系尚不清楚，導(dǎo)致關(guān)節(jié)松弛的基因是否直接影響CHD的產(chǎn)生還需更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；第二，CHD傾向于多基因遺傳調(diào)控，COL6A3和FN1基因可能與CHD疾病有關(guān)聯(lián)，但可能不是與CHD顯著相關(guān)的主效基因，或是這3個SNP位點(diǎn)并不能代表COL6A3及FN1基因的影響作用；第三，本次研究對象的樣本量較小，有待擴(kuò)大樣本進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，COL6A3和FN1基因的CFA25∶51031100，51040259和CFA37∶25095511 SNP位點(diǎn)均不能作為拉布拉多犬與金毛尋回獵犬髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的實(shí)用性遺傳學(xué)診斷指標(biāo)。我們將繼續(xù)檢測其他與CHD相關(guān)候選基因的可能性遺傳標(biāo)記，以期為拉布拉多犬與金毛尋回獵犬幼犬的選育探尋有效的CHD遺傳學(xué)診斷方法。