李潔 孫濤 孫玉霜 曹建森 劉建文

1.天津市動物疫病預(yù)防控制中心

2.天津市西青區(qū)畜牧獸醫(yī)站

布魯氏菌?。˙rucellosis），又稱地中海弛張熱、馬耳他熱、波浪熱，是由布魯氏菌引起的人和牛、羊、豬等的重要人畜共患病。羊是重要易感動物,以母畜流產(chǎn)和公畜睪丸炎為主要特征。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將布魯氏菌病列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。布魯氏菌病的流行嚴(yán)重影響我市畜牧業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。

天津市屬于布魯氏菌病防控一類地區(qū)，我市采取肉羊布魯氏菌病強制免疫和監(jiān)測凈化的防治策略，對種羊采取非免疫監(jiān)測凈化的策略。本試驗采用三種不同血清學(xué)檢測方法——布魯氏菌病抗體cELISA檢測技術(shù)、免疫膠體金快速檢測技術(shù)及虎紅平板凝集檢測技術(shù)，在羊群經(jīng)口免疫S2疫苗后進(jìn)行抗體監(jiān)測，旨在了解羊群免疫布魯氏菌S2疫苗后的抗體陽性率消減規(guī)律及不同血清學(xué)檢測方法敏感性的比較，為制定科學(xué)合理的免疫凈化程序和抗體檢測方法的選取提供理論依據(jù)，為我市肉羊布魯氏菌病免疫和防控工作提供參考。

一、材料與方法

1.實驗材料試驗設(shè)計

1）試驗動物。隨機選取某集約化肉羊養(yǎng)殖場60日齡健康綿羊30只。肉羊的飼養(yǎng)場所、飼料、飼養(yǎng)人員等養(yǎng)殖情況均相同。

2）免疫疫苗。羊群免疫所用疫苗為同一批次布魯氏菌弱毒活疫苗（S2株），疫苗在有效期內(nèi)，購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司。

3）診斷試劑。三種血清學(xué)檢測試劑分別是：虎紅平板凝集試驗抗原及陰陽性對照血清（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）、牛布魯氏菌病抗體膠體金檢測卡（購自深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司）、牛布魯氏菌病抗體ELISA試劑盒（由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供）。

4）儀器設(shè)備：移液器、離心管、離心機、酶標(biāo)儀。

2.試驗方法。對備選健康羊群經(jīng)口免疫接種布魯氏菌?。⊿2）弱毒苗，標(biāo)準(zhǔn)劑量為6×1010CFU活菌。免疫后分別用布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗、牛布魯氏菌病抗體膠體金快速檢測技術(shù)和牛布魯氏菌抗體ELISA試驗方法。對免疫奶牛持續(xù)進(jìn)行抗體監(jiān)測。分別在免疫前和免疫后7d、15d、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月采集全血檢測。

3.結(jié)果判定。布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗按照國標(biāo)（GB/T 18646-2002）進(jìn)行操作和結(jié)果判定?；⒓t平板凝集試驗在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進(jìn)行判定。受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽性(+)，無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性(-)。

布魯氏菌病抗體快速檢測試紙條表面有字母“T”和“C”作為測試線和控制線。在提供任何樣品前，測試線和控制線在結(jié)果窗中都不顯示。控制線被用作程序控制。如果測試正常的完成，控制線試劑會工作，而且控制線會始終顯示。如果在樣品中含有足夠的布魯氏桿菌抗體，一條紫色的測試線會在結(jié)果窗口中顯示。

cELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)為：在陰陽性對照結(jié)果成立的情況下，抑制率（PI）≥30%判為陽性，抑制率（PI）＜30%判為陰性。

圖1 肉羊經(jīng)口免疫布魯氏菌病S2疫苗后抗體陽性率消減規(guī)律

二、結(jié)果

肉羊經(jīng)口免疫布魯氏菌病S2疫苗后抗體陽性率消減規(guī)律見圖1。肉羊經(jīng)口免疫布魯氏菌病S2疫苗后三種方法檢測陽性率統(tǒng)計見表1。

表1 肉羊經(jīng)口免疫布魯氏菌病S2疫苗后三種方法檢測陽性率（%）

三、分析與討論

1.免疫前使用血清學(xué)三種方法對30只健康羊進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為抗體陰性，符合試驗條件。5月4日對30只羊進(jìn)行免疫。免疫后7d出現(xiàn)抗體陽性結(jié)果。根據(jù)羊群免疫后抗體消長規(guī)律曲線顯示，免疫后1周可以檢測到免疫抗體，15d開始抗體陽性率進(jìn)入高峰期。也有研究表明，羊群免疫S2疫苗后，在15～30d抗體凝集達(dá)到高峰。本試驗顯示，免疫抗體高峰持續(xù)50d左右，隨后群體中動物抗體檢測陽性率逐漸下降，5～6個月以后基本無法檢測到免疫抗體。免疫后5個月采血，三種方法均未檢測出陽性。

2.布魯氏菌弱毒活疫苗（S2）免疫健康羊群后能夠有效激發(fā)免疫應(yīng)答，檢測抗體陽性率上升。布病疫苗以黏膜免疫和細(xì)胞免疫為主，現(xiàn)有血清學(xué)檢測方法主要用于體液免疫抗體的檢測，因此在免疫高峰期的抗體陽性率僅為50%。免疫后，血清學(xué)檢測陽性率不能完全體現(xiàn)個體抗體覆蓋率。

3.布魯氏菌免疫后期雖然檢測抗體陽性率逐漸下降，但是羊群仍然能夠保持一定的黏膜免疫和細(xì)胞免疫的保護(hù)力。臨床上在肉羊免疫凈化工作中推薦為每年定期免疫布魯氏菌病疫苗1次，每次免疫前進(jìn)行血清學(xué)篩查，發(fā)現(xiàn)檢測陽性肉羊進(jìn)行撲殺并進(jìn)行無害化處理。逐年免疫清群，能夠減低個體流行率，逐年清群后可達(dá)到布魯氏菌病凈化的目的。

4.三種檢測方法進(jìn)行比較，其中虎紅平板試驗和膠體金兩種方法具有操作簡單、快捷、便宜等特點，虎紅平板凝集試驗的結(jié)果根據(jù)肉眼判定，存在主觀偏移，可能造成結(jié)果偏差。而cELISA的試劑和設(shè)備成本較高，優(yōu)點是檢測敏感性和特異性較高且可以批量檢測?；⒓t平板凝集試驗推薦用于臨床初步篩查，可以使用cELISA進(jìn)行確診。