王玲玲 劉曉燕 馬貴范 王吝安

摘? 要：采用藥敏試驗(yàn)法、抗生素除菌法、帶菌株與無菌株生長(zhǎng)比較法，研究了鹽藻中雜菌對(duì)不同抗生素的敏感性、不同抗生素對(duì)鹽藻藻株生長(zhǎng)的影響、抗生素對(duì)鹽藻的無菌化處理方式、無菌株和帶菌株生長(zhǎng)曲線變化。結(jié)果表明：200μg·mL-1氨芐青霉素、50μg·mL-1頭孢呋辛、400μg·mL-1慶大霉素3種抗生素聯(lián)合逐次使用，可實(shí)現(xiàn)鹽藻藻株的無菌化處理，且對(duì)藻株生長(zhǎng)的影響不顯著（P>0.05）;帶菌鹽藻與無菌鹽藻在延滯期和指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞密度差異不顯著，穩(wěn)定期后無菌藻可以保持較長(zhǎng)一段時(shí)間的穩(wěn)定生長(zhǎng)，但帶菌鹽藻細(xì)胞密度下降，易下沉老化。

關(guān)鍵詞：杜氏鹽藻;無菌化;抗生素;比生長(zhǎng)率;細(xì)胞密度

中圖分類號(hào) Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）11-0017-5

Abstract：Sensitivity test，antibiotic sterilization and comparison of non-axenic strain and axenic strain growth were used to investigate the susceptibility of hybrid bacteria in Dunaliella salina to different antibiotics，the effect of different antibiotics on the growth of Dunaliella salina strains，the axenation of Dunaliella salina by antibiotics，and the changes in growth curve of non-axenic strains and axenic strains. The results showed that the axenation of Dunaliella salina strains could be achieved by successive use of 200 μg·mL-1 ampicillin，50 μg·mL-1 cefuroxime and 400 μg·mL-1gentamicin，and its effect on the growth of Dunaliella salina strains was not significant. No significant difference was found in the lag phase and exponential phase between non-axenic strains and axenic strains. After the stationary phase，the axenic strains kept the cell density for a period of time，but the cell density of non-axenic strains decreased and were prone to aging.

Key words：Dunaliella salina;Axenation;Antibiotics;growth rate;Cell density

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）富含蛋白質(zhì)、天然胡蘿卜素等具有特殊生物活性的物質(zhì)，是目前公認(rèn)的具有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值的微藻[1]。鹽藻的無菌純種是研究鹽藻生理生態(tài)學(xué)、分子學(xué)等的基礎(chǔ)，也是進(jìn)行遺傳工程、鹽藻資源開發(fā)的關(guān)鍵[2]。在培養(yǎng)過程中，由于藻種常伴有雜菌，而無法準(zhǔn)確開展藻-菌相互作用、兼養(yǎng)異養(yǎng)等方面的研究[3]?？股乜梢种萍?xì)菌的繁殖，在除菌抑菌方面表現(xiàn)出了強(qiáng)大作用。為此，筆者以抗生素為除菌工具，在實(shí)驗(yàn)室條件下[4]研究了不同抗生素對(duì)杜氏鹽藻無菌處理效果及其對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的影響，并獲得了無菌杜氏鹽藻株系，以期為開展鹽藻大規(guī)模異養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藻種來源 實(shí)驗(yàn)用鹽藻篩選分離于山東省榮成市桑溝灣自然水域，經(jīng)分子鑒定為杜氏鹽藻。

1.2 培養(yǎng)基 鹽藻培養(yǎng)基采用f/2培養(yǎng)基[5]：其中NaNO3 74.8mg、NaH2PO44.4mg、NaSiO310.0mg、“f/2”微量元素溶液1mL、“f/2”維生素溶液配方1mL，過濾海水1000mL，鹽度60‰、pH為8.0、121℃、0.11MPa滅菌20min待用。細(xì)菌培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂15～20g、純水1000mL、pH為7.5;121℃、121℃、0.11MPa條件下滅菌20min待用。

1.3 主要試劑 化學(xué)試劑硝酸鈉、磷酸二氫鈉等分析純?cè)噭旖蚩泼軞W化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);氨芐青霉素、頭孢呋辛、麥迪霉素等藥敏紙片（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：WS/T125-1999）杭州天和微生物有限公司生產(chǎn);萬古霉素等抗生素購(gòu)自Sigma公司，參照薩姆布魯克等[6]法配制抗生素母液，配制的抗生素母液，用0.22μm的玻璃纖維濾膜過濾除菌。

1.4 主要儀器 智能光照培養(yǎng)箱（型號(hào)為KGHP-160/E），購(gòu)自上海百典儀器設(shè)備有限公司;電子天平（型號(hào)為BS2202S），購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;高壓蒸氣滅菌鍋（型號(hào)為XFH-50CA），購(gòu)自浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;可見分光光度計(jì)（型號(hào)為V-1200），購(gòu)自翱藝儀器（上海）有限公司。

2 方法

2.1 鹽藻培養(yǎng)條件 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置溫度26℃，光暗比12h∶12h，光照強(qiáng)度3000～4000lx，每天振蕩2次。

2.2 藻液中細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，1∶10接種到牛肉膏蛋白胨液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)菌擴(kuò)大培。24h后吸取該藻液10μL，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，采用藥敏試驗(yàn)法檢測(cè)藻液中細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素、頭孢呋辛、麥迪霉素、萬古霉素、多黏霉素B、氯霉素、慶大霉素、硫酸鏈霉素、強(qiáng)力霉素和克林霉素10種抗生素的敏感性，每個(gè)平板上平貼2個(gè)濾紙片，每組設(shè)置3個(gè)平行平板，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d，記錄抑菌圈的大小，選擇抑菌圈大于30mm的抗生素作為除菌工具。

2.3 鹽藻對(duì)不同抗生素及濃度的敏感性檢測(cè) 根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，取抑菌效果較為理想的氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素和頭孢呋辛4種抗生素母液按照一定體積加入到150mL鹽藻藻液中，使其終質(zhì)量濃度分別為50、100，200、400μg·mL-1，每組設(shè)置3個(gè)平行，以未加抗生素的微藻作為對(duì)照，培養(yǎng)條件如2.1，培養(yǎng)9d。每天定時(shí)記錄鹽藻的生長(zhǎng)密度。

2.4 抗生素單一和聯(lián)合除菌試驗(yàn) 根據(jù)藻液中細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性和鹽藻對(duì)不同抗生素及濃度的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取慶大霉素、氨芐青霉素、頭孢呋辛3種抗生素按照表1中9種方案對(duì)鹽藻進(jìn)行除菌試驗(yàn)，培養(yǎng)條件如2.1，培養(yǎng)9d，每天定時(shí)記錄鹽藻的生長(zhǎng)密度;以未加抗生素的鹽藻藻液為對(duì)照組。

2.5 無菌檢測(cè) 分別取2.4試驗(yàn)中經(jīng)過抗生素除菌處理的鹽藻藻液10μL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。初步認(rèn)定無菌后，再經(jīng)3次傳代培養(yǎng)（按1∶10的接種量培養(yǎng)于150mL的三角瓶中，每代培養(yǎng)9d），培養(yǎng)條件同2.1，徹底消除殘留抗生素影響。再取各組藻液10μL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.6 自然帶菌藻和無菌鹽藻生長(zhǎng)曲線比較 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的帶菌和無菌藻液，接種于150mL的f/2培養(yǎng)基中，接種初始密度均為0.5×106個(gè)·mL-1，培養(yǎng)28d，每天定時(shí)記錄鹽藻細(xì)胞密度。取樣時(shí)均遵循無菌操作規(guī)則。

2.7 生長(zhǎng)情況測(cè)定方法

2.7.1 細(xì)胞密度的測(cè)定 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)鹽藻細(xì)胞密度，再使用V-1200分光光度計(jì)測(cè)定相應(yīng)細(xì)胞濃度下的藻液OD630值，繪制吸光度與藻細(xì)胞密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每天測(cè)定實(shí)驗(yàn)藻液的OD630值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度，每個(gè)樣計(jì)3次，取平均數(shù)。

2.7.2 比生長(zhǎng)速率測(cè)定 比生長(zhǎng)速率μ=（lnNt-lnN0）/T，其中Nt為培養(yǎng)t天時(shí)的細(xì)胞數(shù)，N0為初始時(shí)的細(xì)胞數(shù)，T為培養(yǎng)時(shí)間。

2.8 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 23.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和LSD多重比較及t檢驗(yàn)法，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 藻液中細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性 由表2可知，10種抗生素對(duì)鹽藻藻液中的細(xì)菌都有不同程度的抑菌殺菌作用。根據(jù)形成的抑菌圈直徑的大小，判斷鹽藻藻液中細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性從強(qiáng)到弱依次是：氨芐青霉素>氯霉素>慶大霉素>頭孢呋辛>硫酸鏈霉素>麥迪霉素>多黏霉素B>萬古霉素>強(qiáng)力霉素>克林霉素。其中，氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素、頭孢呋辛藥敏紙片上抑菌圈平均直徑在30～40mm，麥迪霉素、多黏霉素B、硫酸鏈霉素藥敏紙片上抑菌圈平均直徑在20～30mm，萬古霉素、強(qiáng)力霉素、克林霉素藥敏紙片上抑菌圈平均直徑在10～20mm，選取抑菌圈直徑>30mm的4種抗生素進(jìn)一步檢驗(yàn)鹽藻對(duì)其的敏感性。

3.2 鹽藻對(duì)不同抗生素及濃度的敏感性 根據(jù)圖1～圖4結(jié)果可知，不同抗生素種類和質(zhì)量濃度可以引起鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)密度的不同變化。當(dāng)頭孢呋辛質(zhì)量濃度50μg·mL-1時(shí)，鹽藻細(xì)胞的生長(zhǎng)密度高于對(duì)照組;當(dāng)青霉素質(zhì)量濃度為50、100和200μg·mL-1時(shí)，頭孢呋辛的質(zhì)量濃度為100μg·mL-1時(shí)，慶大霉素的質(zhì)量濃度為50、100、200和400μg·mL-1時(shí)，鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)的密度變化與對(duì)照組接近;氨芐青霉素的質(zhì)量濃度為400μg·mL-1時(shí)，頭孢呋辛的質(zhì)量濃度200、400μg·mL-1時(shí)，氯霉素的質(zhì)量濃度在50、100、200和400μg·mL-1時(shí)鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)密度低于對(duì)照組，且氯霉素各濃度組中細(xì)胞出現(xiàn)明顯的下沉老化現(xiàn)象。

采用單因素方差分析和LSD多重比較法，比較各抗生素各濃度組對(duì)鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)密度的影響，結(jié)果如表3所示。由表3可知，當(dāng)氨芐青霉素的質(zhì)量濃度為50、100和200μg·mL-1時(shí)，頭孢呋辛的質(zhì)量濃度50、100μg·mL-1時(shí)，慶大霉素的質(zhì)量濃度為50、100、200和400μg·mL-1時(shí)，鹽藻細(xì)胞的生長(zhǎng)密度與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。但當(dāng)頭孢呋辛的質(zhì)量濃度為200、400μg·mL-1時(shí)，氯霉素的質(zhì)量濃度為50、100、200和400μg·mL-1時(shí)，鹽藻藻株生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，鹽藻藻株生長(zhǎng)則受到明顯抑制，且與對(duì)照組差異極顯著（P<0.01）。

3.3 鹽藻的無菌化處理和無菌檢測(cè) 比較各抗生素處理組中鹽藻的生長(zhǎng)情況，如圖5所示。由圖5可知，按照無菌化方案Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ進(jìn)行處理，鹽藻藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率與對(duì)照組無明顯差異（P>0.05），按照無菌化方案Ⅴ進(jìn)行處理，其比生長(zhǎng)速率低于對(duì)照組，且與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）;按照無菌化方案Ⅵ進(jìn)行處理，其比生長(zhǎng)速率則明顯低于對(duì)照組，且與對(duì)照組差異極顯著（P<0.01）。各無菌化處理方案獲得的鹽藻經(jīng)3次傳代之后，接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，結(jié)果表明，經(jīng)過無菌化方案Ⅵ、Ⅸ處理，鹽藻藻株已無細(xì)菌污染，而按照無菌化方案Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ處理仍有細(xì)菌存在。綜合各方案除菌效果和對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的影響，鹽藻無菌化處理方案優(yōu)選無菌化處理方案Ⅸ。

3.4 自然帶菌藻和無菌鹽藻的生長(zhǎng)曲線 比較帶菌藻和無菌藻的生長(zhǎng)曲線，如圖6所示，第1～12d帶菌藻與無菌藻生長(zhǎng)曲線無明顯差異，第1～3d為延滯期，第4d進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，第11d進(jìn)入穩(wěn)定期;但進(jìn)入第13d后，帶菌藻液細(xì)胞數(shù)量下降，出現(xiàn)下沉等老化現(xiàn)象，而無菌藻液細(xì)胞數(shù)量可以保持一段時(shí)間的穩(wěn)定且藻液顏色均勻，未有藻細(xì)胞下沉等老化現(xiàn)象。

4 討論和結(jié)論

4.1 無菌化處理中抗生素的選擇 抗生素能夠有效抑制或殺滅細(xì)菌，是微藻無菌化處理的常用方法[7]?？股氐氖褂眯杈邆湟韵?個(gè)基本條件，一是具有高效抑菌殺菌活性，二是對(duì)微藻細(xì)胞毒性低。由于抗生素的抗菌譜存在差異，各微藻液中菌落結(jié)構(gòu)不同，采用抗生素抑制或殺滅藻液中的細(xì)菌，在不同藻種以及劑量方面存在差異。鄭凌凌[8]等研究表明，使用卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素可以實(shí)現(xiàn)對(duì)雨生紅球藻FACHB-712藻株無菌化處理。周文俊[9]等研究表明，卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素可以完成對(duì)球等鞭金藻的無菌化處理。本研究選用了具有不同抗菌機(jī)理的氨芐青霉素、慶大霉素、萬古霉素等10種抗生素檢測(cè)對(duì)鹽藻藻液中細(xì)菌的抑制作用，同時(shí)為避免抗生素的使用抑制微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)行了鹽藻藻株對(duì)抗生素耐受性實(shí)驗(yàn)，最終篩選質(zhì)量濃度為200μg·mL-1的氨芐青霉素、50μg·mL-1的頭孢呋辛和400μg·mL-1慶大霉素作為鹽藻無菌化處理的抗生素。

4.2 抗生素使用方法的選擇 多種抗生素聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，可有效去除藻液中的細(xì)菌，獲得無菌藻株。李靜華[10]等應(yīng)用多種抗生素組合處理獲得波吉卵囊藻的無菌株;黃振華[11]等應(yīng)用青霉素、慶大霉素等多種抗生素組合也獲得了球等邊金藻的無菌藻株;Cottrell[12]等認(rèn)為作用機(jī)制的不同可能導(dǎo)致合用抗生素間產(chǎn)生拮抗，因此他們?cè)谖⒃宄胁捎昧酥鸱N抗生素加入法也取得了成功。本研究設(shè)計(jì)了3種抗生素的單一使用，聯(lián)合同時(shí)及聯(lián)合逐次3種方式9種方案，結(jié)果顯示，氨芐青霉素、慶大霉素、頭孢呋辛3種聯(lián)合使用的除菌效果優(yōu)于單一使用某一抗生素，且逐次使用抗生素可以減少對(duì)藻株生長(zhǎng)量的影響同時(shí)獲取無菌藻株。但林偉[13]等研究發(fā)現(xiàn)，抗生素逐種加入不能獲得無菌的扁藻1040、中肋骨條藻及錐狀斯克利普藻，而同樣的聯(lián)合使用可以獲取無菌藻株，未發(fā)現(xiàn)抗生素對(duì)微藻細(xì)胞毒性的增強(qiáng)，研究結(jié)果的差異可能與抗生素使用的種類和濃度，以及體系中雜菌與藻細(xì)胞的相互關(guān)系相關(guān)。

4.3 抗生素?zé)o菌化處理對(duì)藻株的生長(zhǎng)的影響 抗生素?zé)o菌化處理帶來的最大改變是微藻生長(zhǎng)體系中細(xì)菌的數(shù)量和種類的改變，菌-藻之間有可能存在著共生、拮抗、互生等相互關(guān)系，一方種類和數(shù)量的改變會(huì)打破原有的平衡，本研究發(fā)現(xiàn)，無菌鹽藻和帶菌鹽藻在延滯期和指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞生產(chǎn)密度差異不顯著，但到達(dá)穩(wěn)定期后自然帶菌鹽藻出現(xiàn)細(xì)胞密度下降，下沉老化的現(xiàn)象。形成這種現(xiàn)象的機(jī)理，有待進(jìn)一步研究菌-藻之間的關(guān)系。

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（責(zé)編：張宏民）