山丹種子表面滅菌方法篩選試驗初報

陳靜 李發(fā)虎 李龍梅 侯佳

摘 ? 要 ?山丹別名細(xì)葉百合，為百合科百合屬卷瓣組的多年生草本植物。山丹抗性強(qiáng)、花期長，極具觀賞價值，是北方地區(qū)難得的城市綠化、美化材料。為提高組織培養(yǎng)效率，加快山丹的工廠化育苗進(jìn)程，以3年生細(xì)葉百合種子為試材，觀察無菌播種中不同表面滅菌方法對污染率、種子生長情況的影響，結(jié)果表明在光照強(qiáng)度2 000 lx、溫度（25±2） ℃的培養(yǎng)條件下，用75%乙醇消毒30 s配合0.1%NaClO處理15 min，可以取得較高的發(fā)芽率，保證較高的幼苗質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 ? 山丹;組織培養(yǎng);品種改良;污染率;發(fā)芽率

中圖分類號：S682.2+9 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.16.017

山丹（Lilium pumilum DC.）別名細(xì)葉百合，為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）卷瓣組的多年生草本植物。我國野生山丹種質(zhì)資源豐富，在河北、河南、陜西、山西、山東、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、遼寧、吉林、黑龍江、青海、北京等多省（市）廣泛分布[1]。山丹適應(yīng)性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗寒、抗旱性和抗病害能力，且花期長，是北方地區(qū)難得的城市綠化、美化材料。山丹具抗寒、抗病等優(yōu)良性狀，是百合抗性育種和品質(zhì)改良的重要基因資源[2-4]。山丹中含有甾體皂苷、生物堿、磷脂、硝酸甘油酯、多糖等多種活性成分，具有抗抑郁、抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性[5]。近年來人們逐漸認(rèn)識到山丹廣闊的應(yīng)用前景，在組織培養(yǎng)和品種改良方面做了大量工作，推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

百合屬植物具有較高的再生能力，已經(jīng)報道的組織培養(yǎng)方法達(dá)40多種[6]。組織培養(yǎng)可以有效提高山丹繁殖效率，改善品質(zhì)退化等，目前已經(jīng)建立了山丹離體快繁的再生體系，并對山丹組培苗的繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及移栽條件進(jìn)行了研究[7-10]。在實踐操作中，山丹組織培養(yǎng)存在生長緩慢、愈傷組織誘導(dǎo)率低、分化緩慢等問題，不利于工廠化生產(chǎn)推廣。前人的研究表明，山丹種子在20～25 ℃時，有較高的萌發(fā)率，近90%，栽培后，種子萌發(fā)率下降至不足60%。弱光（10～20 μmol·m-2·s-1）能有效縮短山丹種子萌發(fā)完全所需的時間，并提高種子萌發(fā)率[11-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為蒙草公司種質(zhì)資源研發(fā)中心種質(zhì)圃內(nèi)栽培的3年生細(xì)葉百合種子。采種時間為2016年9月，將采收的細(xì)葉百合種子置于4 ℃低溫黑暗處保存。本試驗選擇飽滿、胚清晰（胚長≥1/2種長）的種子為材料，于2017年3—5月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技園區(qū)組織培養(yǎng)中心進(jìn)行。

1.2 試驗方法

1.2.1 預(yù)處理

試驗參考馬儀迪等[12]的巨球百合種子無菌播種方法進(jìn)行。將種子置于添加洗潔精1～2滴的水溶液中浸泡30 min，去除干癟的種子;流水沖洗2～4 h，用軟毛刷輕輕刷洗種子表面，并用無菌濾紙吸干種子表面水分。

1.2.2 滅菌處理

在超凈工作臺內(nèi)，首先用70%乙醇消毒30 s，再用無菌水振蕩沖洗3次;以1%NaClO和0.1%的升汞做振蕩處理（滅菌時間分別為0， 5， 10， 15， 20， 25， 30 min），再用無菌水蕩洗3次，用滅菌濾紙吸干水分后，將種子接種到MS培養(yǎng)基上。試驗采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)接種3瓶，每瓶接種5枚種子。

1.2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加6-BA 0.5 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1這兩種植物激素。無菌培養(yǎng)室光照度約2 000 lx，每天光照13 h，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。每天觀察種子發(fā)芽情況，以胚根露出種皮1～2 mm作為發(fā)芽標(biāo)志。

1.2.4 數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計分析

培養(yǎng)14 d后觀察組培苗的滅菌效果，統(tǒng)計各處理無菌苗的污染率。培養(yǎng)21 d后統(tǒng)計發(fā)芽率，并用螺旋測微尺測量胚芽長度。

污染率（%）=發(fā)生污染的種子數(shù)/接種的種子數(shù)×100;

發(fā)芽率（%）=發(fā)芽的種子數(shù)/接種的種子數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌處理對污染率的影響

隨著0.1%NaClO處理時間增加，污染率明顯降低（見表1），其中振蕩0 min、5 min處理的種子污染嚴(yán)重，污染率都為100%;振蕩處理10 min的污染率明顯降低，為64.44%;處理15 min后，污染率降到6.77%;隨著處理時間的繼續(xù)增加，污染率穩(wěn)定在10%以下，分別為2.22%、6.67%、4.44%。

2.2 不同滅菌處理對種子發(fā)芽情況的影響

經(jīng)0.1%NaClO處理時間在15 min以內(nèi)的細(xì)葉百合種子，開始萌發(fā)時間變化不大，都為7～8 d，而處理20 min、25 min、30 min的種子開始萌發(fā)時間較晚，為12 d、13 d、15 d（見表2）。隨著0.1%NaClO處理時間增加，細(xì)葉百合種子的完全萌發(fā)時間逐漸延長（除0 min、5 min處理因污染未記錄數(shù)據(jù)），其中10 min和15 min兩個處理的完全萌發(fā)時間最短，為14 d和16 d，30 min處理的完全萌發(fā)時間為22 d。發(fā)芽率記錄結(jié)果顯示，0 min、5 min處理因污染嚴(yán)重未記錄到數(shù)據(jù);10 min處理的發(fā)芽率明顯增加，為60%;處理15 min的發(fā)芽率最高，為91.11%;之后隨著處理時間增加，發(fā)芽率呈逐漸下降的趨勢。

經(jīng)0.1%NaClO處理不同時間的細(xì)葉百合種子，胚芽伸長情況為（0 min、5 min、30 min因污染、死亡或胚芽過短未得到數(shù)據(jù)）隨著處理時間增加，胚芽長度先升增大后減?。ㄒ姳?），其中處理15 min的胚芽最長，為1.545 0 cm。

3 小結(jié)

隨著山丹獨(dú)特的觀賞價值、良好的生態(tài)適應(yīng)性、藥用和營養(yǎng)價值逐漸被市場認(rèn)可，其生產(chǎn)規(guī)模將逐漸擴(kuò)大，工廠化育苗生產(chǎn)將提上日程。與其他百合科植物相比，山丹組織培養(yǎng)增值率低、分化緩慢，在工廠化生產(chǎn)中存在瓶頸。百合種子發(fā)芽率高、生長迅速，但發(fā)芽持續(xù)時間長，可達(dá)40 d以上[11]，生長情況也參差不齊，不符合規(guī)模化生產(chǎn)要求。無菌播種開始萌發(fā)時間短、發(fā)芽持續(xù)時間短，生長情況較為接近，可以作為山丹工廠化生產(chǎn)的有效切入點(diǎn)。

污染是無菌播種過程中的重要問題，決定無菌播種成敗的關(guān)鍵。山丹種子常攜帶大量微生物且難以清除，故明確無菌播種中種子的生理狀態(tài)，篩選最佳滅菌劑種類、滅菌時間及滅菌方法等都是需要解決的問題[13-14]。

試驗結(jié)果表明，0.1%NaClO處理時間在5 min以內(nèi)的，滅菌效果不理想;處理時間在15 min及以上的，滅菌效果較好，且隨著滅菌時間延長，污染率逐漸降低，胚芽生長健壯。0.1%NaClO處理時間在15 min及以下的，開始萌發(fā)時間和完全萌發(fā)時間變化不大，處理20 min以上的開始萌發(fā)時間和完全萌發(fā)時間表現(xiàn)為隨著處理時間延長而明顯增加。隨著0.1%NaClO處理時間的增加，山丹種子的胚芽長度先增大后減小，在15 min處理達(dá)到最大，之后呈明顯下降趨勢，這說明較長時間的0.1%NaClO處理對山丹種子的萌發(fā)會產(chǎn)生不良影響。

綜上所述，山丹無菌播種在光照強(qiáng)度2 000 lx、溫度（25±2） ℃的培養(yǎng)條件下，用75%乙醇消毒30 s配合0.1%NaClO處理15 min，可以取得較高的發(fā)芽率，保證較高的幼苗質(zhì)量。

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（責(zé)任編輯：易 ?婧）