肖文海，楊政偉，李 遠

（1.重慶市大足區(qū)中醫(yī)院，重慶 402360；2.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院中心實驗室，重慶 402160）

大量研究證實機體內(nèi)過量自由基形成及其誘發(fā)的“瀑布式”自由基連鎖反應將造成生物膜損傷、蛋白質(zhì)變性、DNA錯誤復制及酶失活等，進而引發(fā)生物體內(nèi)各種疾病產(chǎn)生[1]。在生理狀態(tài)下，由系列酶和非酶復合物組成的體內(nèi)抗氧化防御體系能夠在氧自由基產(chǎn)生后即時清除以維持體內(nèi)平衡。然而，在嚴重氧化應激條件下，單獨的機體內(nèi)抗氧化體系不能完全消除過量自由基，進而造成機體氧化損傷。另一方面，大量研究顯示一些源于天然植物的物質(zhì)具有抗氧化效應，可作為的潛在藥物有效地抑制和清除機體內(nèi)的過量自由基，進而阻斷自由基參與的一系列不良氧化反應[2]。參麥注射液是由人參、麥門冬為組分制成的中藥復方注射液，中醫(yī)理論上具有“益氣固脫、養(yǎng)陰生津，生脈”功效[3]。此外，一些體內(nèi)和臨床實驗還顯示參麥注射液具有減輕氧自由基對細胞損傷和降低細胞膜脂質(zhì)過氧化的效果，進而用于缺血性腦卒中的臨床治療和改善腦缺血-再灌注導致的肺損傷[4-5]。然而，參麥注射液相關的體外抗氧化性能卻鮮見文獻報道[6]。因此。本研究將系統(tǒng)評價參麥注射液的體外抗氧化活性，為參麥注射液體內(nèi)臨床抗氧化應激藥理學機制提供實驗。

1 試劑和儀器

1.1 主要試劑 2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、檸檬酸、過氧化氫、氯化亞鐵（FeCl2）、菲啰嗪、硝普鈉均為分析純，購于上海麥克林生化科技有限公司；參麥注射液（批號：1703101）由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供，根據(jù)臨床用法用量用生理鹽水分別稀釋10、20、40、60、80 和 100 倍后進行測試；總抗氧化能力（TAC）比色法定量檢測試劑盒（DPPH法）由赫澎（上海）公司提供；總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法）、一氧化氮（NO）檢測試劑盒由碧云天生物技術有限公司提供。

1.2 主要儀器 Varioskan Flash多功能酶標儀（美國熱電）、震蕩恒溫孵育箱（上海智誠）。

2 方法

2.1 總抗氧化能力 參麥注射液總抗氧化能力通過總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法）進行檢測，流程按試劑盒說明書操作。流程如下：首先在96孔板每個檢測孔中加入180 μL FRAP工作液，在樣品孔中加入5 μL不同濃度待測樣品；空白對照孔中加入5 μL生理鹽水；標準曲線孔中加入5 μL不同濃度的FeSO4標準溶液。輕輕混勻，37℃孵育5 min，測試溶液在593 nm波長處的吸光度值。吸光度值越大代表樣品具有越高總抗氧化能力。根據(jù)標準曲線計算參麥注射液的總抗氧化能力，并用FeSO4標準溶液濃度來表示。實驗以0.1 mg/mL BHT、10 mmol/L水溶性維生素E（Trolox）、10%檸檬酸作為對照進行比較。

2.2 DPPH自由基（DPPH·）清除活性 參麥注射液DPPH·清除活性采用總抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH法）定量檢測試劑盒進行測量，按試劑盒說明書操作。流程如下：取20 μL不同濃度待測樣品加入96孔板中，加入試劑盒提供的205 μL緩沖液，25 μL染色工作液，輕搖96孔板混勻，室溫孵育15 min后，測試混合液在515nm波長處吸光度值，吸光度值越低代表樣品具有越高的DPPH·清除活性。DHHP·清除活性（%）=（Ac-As）/Ac×100，Ac 為空白組吸光度值、As為含不同樣品的混合液吸光度值。實驗以 0.1mg/mL BHT、10mmol/L Trolox、10%檸檬酸作為對照進行比較。

2.3 一氧化氮自由基（NO·）清除能力 參麥注射液NO·清除能力通過Griess法反應進行量化[7]，按NO檢測試劑盒說明書操作。流程如下：將1 mL不同濃度待測樣品與1 mL濃度為10 mmol/L的硝普鈉溶液中混合，25℃孵育150 min。取50 μL混合液加入到96孔板中，依次加入劑盒中提供的50 μL Griess Reagent I、50 μL Griess Reagent II溶液，充分混合后室溫反應10 min，測試溶液在540 nm波長吸光度值，吸光度值越低表示樣品具有越高的NO·清除活性。NO·清除活性（%）=（Ac-As）/Ac×100，Ac為空白組吸光度值，As為含不同樣品的混合液吸光度值。實驗以 0.1 mg/mL BHT、10 mmol/L Trolox、10%檸檬酸作為對照進行比較。

2.4 過氧化氫（H2O2）清除能力 參麥注射液H2O2清除能力測試參考文獻[8]。流程如下：用生理鹽水配置40 mmol/L過氧化氫溶液；取100 μL不同濃度待測樣品加入到600 μL過氧化氫溶液中，用生理鹽水定容到3 mL，室溫震蕩孵育30 min；空白樣品中只含生理鹽水和過氧化氫溶液；測試溶液在230 nm波長處的吸光度值。吸光度值越低代表樣品具有越高的 H2O2清除活性。H2O2清除活性（%）=（Ac-As）/Acx100，Ac為空白組吸光度值，As為含樣品溶液吸光度值。實驗以0.1 mg/mL BHT、10 mmol/L Trolox、10%檸檬酸作為對照進行比較。

2.5 亞鐵（Fe2+）離子螯合活性 參麥注射液Fe2+離子螯合活性測試參考文獻[9]。流程如下：取100 μL不同濃度待測樣品加入生理鹽水400 μL，隨后依次加入 10 μL 2 mmol/L FeCl2溶液和 20 μL 菲啰嗪溶液，混勻后室溫孵育10 min，空白對照中不含待測樣品。測試混合溶液在562 nm波長處吸光度值，吸光度值越低代表樣品具有越高Fe2+離子螯合活性。Fe2+離子螯合活性（%）=（Ac-As）/Ac×100，Ac 為空白樣品吸光值，As為含樣品溶液吸光度值。實驗以0.1 mg/mL BHT、10 mmol/L Trolox、10%檸檬酸作為對照進行比較。

2.6 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有實驗數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差（x±s）表示。多組間均值比較采用單因素方差分析，分析前采用Levene法對多組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊性條件滿足時采用Dunnett-t進行均值比較，方差齊性條件不滿足時采用Dunnett’s T3進行兩兩比較，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 總抗氧化能力 不同稀釋倍率參麥注射液總抗氧化能力如圖1（A）所示，顯示總抗氧化能力隨稀釋倍率減少而增大。稀釋10倍參麥注射液總抗氧化能力顯著低于 BHT、Trolox抗氧化能力（P＜0.01），但高于檸檬酸總抗氧化能力（P＜0.01），結(jié)果如圖1（B）所示。

3.2 DPPH·清除活性 不同稀釋倍率的參麥注射液DPPH·清除活性如圖 1（C）所示，顯示 DPPH·清除活性隨稀釋倍率減少而增大。稀釋10倍參麥注射液DPPH·清除活性顯著低于BHT、Trolox抗氧化能力（P＜0.01），與檸檬酸DPPH·清除活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），如圖 1（D）所示。

3.3 NO·清除活性 不同稀釋倍率的參麥注射液NO·清除活性見圖1（E）所示，顯示其NO·清除活性稀釋倍率減少而增大。稀釋10倍參麥注射液NO·清除活性顯著高于BHT（P＜0.05）、Trolox和檸檬酸（P＜0.01），如圖 1（F）所示。

3.4 H2O2清除活性 不同稀釋倍率的參麥注射液H2O2清除活性見圖1（G）所示，顯示其H2O2清除活性稀釋倍率減少而增大。稀釋10倍參麥注射液H2O2清除活性與檸檬酸相當（P＞0.05），顯著低于BHT（P＜0.01）和 Trolox（P＜0.05），如圖 1（H）所示。

3.5 Fe2+離子螯合活性 不同稀釋倍率的參麥注射液Fe2+螯合活性隨稀釋倍率減少而增大，見圖1（I）所示。稀釋10倍參麥注射液亞鐵離子螯合活性顯著高于 BHT、Trolox和檸檬酸（P＜0.01），如圖 1（J）所示。

3.6 不同自由基清除活性比較 10倍稀釋參麥注射液對不同自由基具有不同的清除能力，其中，NO·[（54.4±6.6）%]＞Fe2+離子螯合[（42.6±3.2）%]＞DPPH·[（36.2±2.8）%]＞H2O2[（23.5±1.2）%]。

圖1 參麥注射液體外抗氧化活性Fig.1 In vitro antioxidant activity of Shenmai injection

4 討論

近年來大量研究表明生物體內(nèi)過量的氧自由基及氧化應激是導致心血管系統(tǒng)、腫瘤及退行性病變的重要原因之一[10]。參麥注射液作為人參、麥門冬為組分制成的中藥復方注射液，除具有“益氣固脫、養(yǎng)陰生津，生脈”的中醫(yī)功效外，在機體內(nèi)還具有潛在的抗氧化作用，可用于臨床改善缺血性腦卒中帶來的氧化應激損傷[11]。為闡明臨床上參麥注射液的抗氧化應激機制，本研究體外系統(tǒng)研究了參麥注射液抗氧化性能，并與BHT（人工合成抗氧化劑）、Trolox（維生素E類似物，抗氧化能力與維生素E相當）和檸檬酸（天然抗氧化物質(zhì)）3種常用抗氧化劑的體外抗氧化性能進行比較。

參麥注射液總抗氧化能力采用FRAP法進行分析。本結(jié)果說明參麥注射液樣品中的含有某種抗氧化性活性成分，且10倍稀釋參麥注射液總抗氧化能力高于檸檬酸，但低于BHT和Trolox。進一步證實參麥注射液具有體內(nèi)抗氧化性能的物質(zhì)基礎。

DPPH·是一種穩(wěn)定呈紫紅色的自由基，在515nm波長處有最大的吸收峰。當溶液中有抗氧化成份存在時，可向DPPH·提供氫原子和電子，使其發(fā)生褪色。溶液吸光度值降低越多，說明抗氧化成份抗氧化性越強。不同稀釋倍數(shù)的參麥注射液清除DPPH·的活性結(jié)果說明參麥注射液具有一定的清除DPPH·功能，其活性與檸檬酸相當，但低于BHT和Trolox。

NO·是活性氧自由基（ROS）家族中重要成員，在人體內(nèi)可作為內(nèi)皮細胞松弛因子、神經(jīng)信號傳導逆信使參與眾多的炎癥反應、腫瘤、腦卒中和其它退行性病理條件[12]。在本測試中，NO·由硝普鈉提供，抗氧化物質(zhì)清除后剩余的NO·在水溶液中氧化形成二氧化氮（NO2），并能夠與Griess試劑反應生成在540 nm波長具有最大吸收峰的反應物。樣品清除NO·活性越大，混合物吸光度值越低。不同稀釋倍率的參麥注射液NO·清除活性結(jié)果證實了參麥注射液具有清除NO·能力，10倍稀釋的參麥注射液NO·清除活性高于BHT、Trolox和檸檬酸。

H2O2是一個弱氧化物，雖然其自身氧化反應活性不強，但H2O2可快速地跨過細胞膜，并與膜內(nèi)二價鐵離子和二價銅離子反應生成羥基自由基，從而產(chǎn)生毒性[13]。因此，H2O2的清除是細胞或人體系統(tǒng)中非常重要的抗氧化防御能力。不同稀釋倍率的參麥注射液H2O2清除活性結(jié)果，說明參麥注射液具有一定的H2O2活性，其活性與檸檬酸相當，但低于BHT和Trolox。

過渡金屬Fe2+離子能夠獲得或失去自由電子，具有產(chǎn)生新自由基的能力。大多數(shù)ROS是線粒體電子轉(zhuǎn)移和其它代謝反應過程中形成的副產(chǎn)物，而部分ROS則來源于過渡金屬催化氧化反應。研究顯示過量Fe2+離子造成的ROS氧化損傷與多種神經(jīng)性疾病有關，如老年癡呆癥、帕金森氏病等[14]。因此，過量Fe2+離子的清除具有重要意義，而通過對Fe2+離子的螯合反應能夠降低ROS形成和氧化損傷。不同稀釋倍率的參麥注射液對Fe2+離子螯合活性如圖（I）和（J）所示，說明參麥注射液具有能螯合 Fe2+離子的成份，且螯合Fe2+離子活性高于BHT、Trolox和檸檬酸。

5 結(jié)論

文章系統(tǒng)性地評價參麥注射液的體外抗氧化活性，包括總抗氧化能力、清除DPPH·、NO·、H2O2和亞鐵離子（Fe2+）螯合活性。結(jié)果顯示參麥注射液具有一定的體外抗氧化能力，且活性呈濃度正依賴性。同時證實了參麥注射液對不同自由基清除能力存在差異。本研究結(jié)果將為參麥注射液抗氧化應激藥理學機制提供體外實驗數(shù)據(jù)解釋。文章不足之處在于僅采用單一廠家生產(chǎn)的參麥注射液產(chǎn)品，同時未進行量-效關系分析。