李亞超，馬云云，陶金忠，袁莉剛，李琪，梁晶晶

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

哺乳動(dòng)物睪丸局部激素調(diào)控是精子發(fā)生過程中的關(guān)鍵步驟，其中促黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)是主要調(diào)節(jié)激素之一.LH又稱leydig細(xì)胞刺激素，是leydig細(xì)胞合成和分泌雄激素至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子，亦可反饋抑制下丘腦GnRH和腺垂體FSH及LH的分泌.LH主要通過與睪丸leydig細(xì)胞上的促黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)結(jié)合，在內(nèi)分泌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過程發(fā)揮作用，并參與精子生成、受精卵著床、性腺發(fā)育等一系列生理活動(dòng)[1].免疫組化研究表明，相較于其他各生殖器官，倉鼠睪丸中LHR表達(dá)量最高[2].研究發(fā)現(xiàn)水牛卵泡期卵巢中LHR的表達(dá)量高于黃體期，在黃體期子宮中LHR的表達(dá)量高于卵泡期，表明其參與卵巢黃體生成及誘發(fā)排卵等功能的調(diào)節(jié)[3].研究表明，同一發(fā)情周期中不同發(fā)育階段的山羊子宮內(nèi)LHR mRNA表達(dá)差異明顯，提示其參與發(fā)情周期的調(diào)節(jié)[4].研究報(bào)道繁殖季節(jié)野生公鹿和母鹿垂體中LH陽性表達(dá)比非繁殖季節(jié)強(qiáng)烈[6].研究資料表明，狍、白尾鹿和紅鹿等FSH和LH季節(jié)性分泌的起伏與繁殖期變化相一致[7-9].因此，LH及其受體在生殖器官的表達(dá)差異與動(dòng)物的季節(jié)性繁殖及其調(diào)控關(guān)系密切.

牦牛為高原環(huán)境中的季節(jié)性繁殖動(dòng)物，表現(xiàn)為暖季發(fā)情，其生殖發(fā)育相關(guān)調(diào)節(jié)因子在不同繁殖期有一定的表達(dá)差異.研究報(bào)道VEGF及其受體在性成熟牦牛不同繁殖期睪丸組織中表達(dá)差異明顯，二者參與精子發(fā)生及局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)[10].早期研究表明，LHR在不同年齡牦牛睪丸leydig細(xì)胞及支持細(xì)胞中有表達(dá)，在性成熟及老齡牦牛睪丸呈中等陽性表達(dá)，性成熟青年期牦牛陽性表達(dá)弱有降低，表明其主要起到調(diào)節(jié)leydig細(xì)胞及支持細(xì)胞生理功能的作用[11].在此基礎(chǔ)上，本研究通過組織化學(xué)染色及免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合形態(tài)計(jì)量比較LHR在不同繁殖期牦牛睪丸組織的表達(dá)，分析LHR分布變化與牦牛季節(jié)性發(fā)情的關(guān)系，旨在為高原哺乳動(dòng)物季節(jié)性調(diào)控研究提供形態(tài)學(xué)參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在青海西寧市大通養(yǎng)殖戶采集5歲繁殖期(7～9月)和繁殖間期(1～2月)成年牦牛睪丸樣品，于4%的多聚甲醛溶液固定.

免疫組化染色試劑盒(SP-9001，由美國(guó)ZYED 生產(chǎn)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9108，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；蘇木精-伊紅染料(臺(tái)山市化工有限公司)；過碘酸Schiff染色試劑和阿爾辛藍(lán)過碘酸Schiff染色試劑；LHR抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司).

EPON812包埋機(jī)，LKB8800型超薄切片機(jī)，NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將組織樣品切成1 cm×1 cm×0.6 cm大小，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定，不同梯度酒精脫水，二甲苯透明，組織浸蠟，包埋，連續(xù)切片(5 μm)，制成石蠟切片.

1.2.2 蘇木精-伊紅(H.E)常規(guī)染色 切片梯度酒精脫蠟后，放入蘇木精染液2 min，流水沖洗2次，5 min/次，隨后用1%的鹽酸分化2次，每次2 s；之后用流水沖洗10 min，待切片返藍(lán)后，伊紅染液染色1 min，梯度酒精脫水，二甲苯溶液透明20 min，最后用中性樹脂封片.

1.2.3 PAS和AB糖原染色 切片脫水、脫蠟后，滴加1% AB醋酸水溶液10～20 min，蒸餾水洗2次，用1%過碘酸水溶液氧化5～10 min，滴加Schiff氏試劑染色10～20 min，每張切片滴加50 μL偏重亞硫酸鈉連續(xù)3次，每次2 min，間隔1 min，流水沖洗5～10 min，用蘇木精染液過染2～3 min，鹽酸分化液分化1次，流水沖洗10 min，常規(guī)脫水透明、封片.PAS染色，蘇木精復(fù)染.染色后中性粘蛋白呈紅色.AB染色(pH=2.5)酸性粘蛋白呈藍(lán)色，核淡紅色[12].

1.2.4 免疫組織化學(xué)法 免疫組化(streptavidin-perosidase，SP)法染色，切片梯度酒精脫水、脫蠟后，酒精梯度分化；使用30 g/L H2O2溶液在37 ℃條件下孵育15 min阻斷過氧化物酶活性，隨后用蒸餾水洗1次，5 min/次，PBS洗3次，5 min/次，將5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，37 ℃孵育15 min后傾去血清(即正常山羊血清白蛋白)；在切片上滴加50 μL兔多克隆抗鼠，稀釋度為1∶400的促黃體生成素受體-IgG，在37 ℃條件下孵育4 h， PBS洗滌3次，5 min/次，之后將50 μL生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG工作溶液加入到每個(gè)切片中，37 ℃孵育15 min，PBS洗滌3次，5 min/次，隨后加50 μL適當(dāng)比例PBS稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃條件孵育15 min后用PBS沖洗5 min，洗3次；隨后滴加新鮮配的DAB顯色溶液顯色，常規(guī)脫水透明、封片.陰性對(duì)照用PBS替代兔源一抗進(jìn)行染色.

1.3 數(shù)據(jù)處理

NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行照相.采用半定量的形式對(duì)染色結(jié)果的分布密度進(jìn)行描述，-：無陽性表達(dá)；+/-：偶有陽性表達(dá)；+：陽性表達(dá)；++：中等強(qiáng)度陽性表達(dá)；+++：強(qiáng)陽性表達(dá)；++++：高密度強(qiáng)陽性[13].

隨機(jī)選取5張切片，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)不重復(fù)視野(×400)，用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)染色結(jié)果中每個(gè)視野下陽性信號(hào)強(qiáng)度均值與陽性面積計(jì)算表達(dá)平均吸光度；1組共計(jì)30個(gè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)果計(jì)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，SPSS 15.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析同一蛋白組間表達(dá)量的差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸的組織化學(xué)特點(diǎn)

光鏡下，繁殖期性成熟牦牛睪丸組織生精上皮由4～8層生精細(xì)胞及sertoli細(xì)胞構(gòu)成，大量成熟精子明顯分布于腔面，管周肌樣細(xì)胞圍繞于生精小管固有膜外周，間質(zhì)結(jié)締組織分布明顯，leydig細(xì)胞散布其中(圖1-A,1-B).特殊染色表明，睪丸生精上皮及間質(zhì)PAS紫紅色陽性條帶明顯，生精上皮近腔面處亦可見陽性反應(yīng)(圖1-C)；AB藍(lán)色陽性條帶清晰分布于間質(zhì)毛細(xì)血管壁，leydig細(xì)胞周圍無明顯表達(dá)(圖1-D).繁殖間期睪丸組織的生精上皮為4～6層細(xì)胞，與繁殖期相比，睪丸組織結(jié)構(gòu)變化不明顯(圖1-G,1-H)，PAS紫紅色陽性在睪丸小管基膜及間質(zhì)表達(dá)明顯減弱(圖1-I)，但間質(zhì)毛細(xì)血管壁及生精小管固有膜AB藍(lán)色陽性條帶清晰明顯(圖1-J).

2.2 LHR在成年牦牛睪丸組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，LHR在繁殖期牦牛睪丸組織leydig細(xì)胞、sertoli細(xì)胞為弱陽性表達(dá)，各級(jí)生精細(xì)胞幾乎無表達(dá)(圖1-E，表1)，陰性對(duì)照無表達(dá)(圖1-F).繁殖間期，LHR在leydig細(xì)胞呈高密度強(qiáng)陽性表達(dá)，生精上皮未見明顯表達(dá)(圖1-K)，陰性對(duì)照無表達(dá)(圖1-L).

2.3 LHR在不同周期牦牛睪丸免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析

免疫組織化學(xué)圖像統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，牦牛睪丸組織中LHR在繁殖間期的平均吸光度高于繁殖期，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(圖2).

3 討論

PAS及AB-PAS陽性反應(yīng)的糖原、糖蛋白以及蛋白多糖很典型的存在于睪丸結(jié)締組織、粘液以及基膜中，受體蛋白、腫瘤細(xì)胞表面抗原等亦均屬糖蛋白，粘蛋白及糖類物質(zhì)與睪丸生精功能及激素合成密切相關(guān).早期研究表明，單峰駝睪丸PAS陽性反應(yīng)條帶主要在血管壁及生精小管外周，PAS隨生精小管上皮發(fā)育周期階段性變化而差異明顯，生殖周期早期PAS反應(yīng)最豐富，后期則明顯缺乏[14].單峰駝精子發(fā)生需要多種糖綴合物，其含量隨不同繁殖季節(jié)差異明顯，繁殖期尤為豐富[15].與此相一致，本研究中，PAS在繁殖間期較繁殖期表達(dá)減弱，表明PAS與繁殖上皮發(fā)育營(yíng)養(yǎng)需要密切相關(guān).研究報(bào)道，AB陽性反應(yīng)在老齡小鼠睪丸 leydig 細(xì)胞及基質(zhì)中會(huì)較青年小鼠增強(qiáng)[16]；與此相似，繁殖間期的老齡牦牛睪丸間質(zhì)血管及生精小管固有膜中AB陽性反應(yīng)較青年牦牛增強(qiáng)[17].本研究中，繁殖間期反映酸性粘多糖表達(dá)增強(qiáng)的AB陽性反應(yīng)較繁殖期明顯，繁殖期PAS陽性反應(yīng)的中性粘蛋白表達(dá)則較強(qiáng)，且不同繁殖季節(jié)睪丸局部粘多糖的表達(dá)差異明顯，糖蛋白參與免疫、分泌、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息傳遞、分化的調(diào)節(jié)及再生等，酸性粘多糖可在局部組織中生物還原為相應(yīng)的中性粘多糖，繁殖間期以酸性粘多糖為主，提示可能與局部組織生化反應(yīng)的改變有關(guān)，繁殖活動(dòng)增強(qiáng)主要與中性粘蛋白關(guān)系密切.

LH是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的生殖激素，與細(xì)胞的特異性糖蛋白受體(LHR)結(jié)合激活腺苷酸-蛋白激酶(cAMP/PKA)信號(hào)通路而刺激類固醇激素的合成，在生殖過程發(fā)揮作用[1]；LH與LHR結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)cAMP活化并增多，與Leydig細(xì)胞的發(fā)育、青春期睪酮的分泌以及精子成熟密切相關(guān)[2].盧全生等[18]發(fā)現(xiàn)，SD大鼠睪丸組織LHR水平表現(xiàn)為冬高夏低，表明LHR的表達(dá)受季節(jié)因素的影響.本研究中，LHR在繁殖期牦牛睪丸sertoli細(xì)胞為弱陽性，不同繁殖期的生殖上皮均未見明顯表達(dá)，提示LHR或者并不直接參與性成熟后牦牛不同季節(jié)生精過程的調(diào)節(jié)；大鼠睪丸免疫組化定位顯示，LHR主要表達(dá)于Leydig細(xì)胞膜，也有少量表達(dá)于Leydig細(xì)胞質(zhì)[19]，與此相一致，本研究中LH在leydig細(xì)胞分布為主，繁殖間期的陽性表達(dá)強(qiáng)于繁殖期，提示高原地區(qū)繁殖季節(jié)對(duì)LHR在leydig細(xì)胞的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用.

A～F：繁殖期牦牛睪丸組織；G～L：繁殖間期牦牛睪丸組織；A、B、G、H：HE染色；C、I：PAS染色；D、J：AB染色；E、K：LHR免疫組化染色；F、L：免疫組化染色陰性對(duì)照；BC：毛細(xì)血管；IT：間質(zhì)；Ley：間質(zhì)細(xì)胞；ST：生精小管.A～F：The structure of yak testicle in breeding season；G～L：The structure of yak testicle in non-breeding season；A、B、G、H：The hematoxylin-eosin staining；C、I：The periodic acid Schiff staining；D、J：The Alcian-Blue staining；E、K：The LHR immunohistochemical staining；F、L：The immunohistochemical staining negative control；BC：Blood capillary；IT：Interstitial；Ley：Leydig cells；ST：Seminiferous tubue.圖1 不同繁殖周期成年牦牛睪丸組織化學(xué)特點(diǎn)及LHR表達(dá)比較Figure 1 The comparison of histochemical characteristics and LHR expression in the testicle of adult yak between breeding and non-breeding seasons

表1 LHR在牦牛睪丸繁殖期和繁殖間期不同部位的分布密度Table 1 The density of LHR in different parts of yak testis in the breeding season and the non-breeding season

*同一蛋白組間差異顯著(P<0.05).* means significant difference between groups(P<0.05).圖2 不同繁殖期成年牦牛睪丸LHR表達(dá)統(tǒng)計(jì)Figure 2 The comparison of LHR expression in the testicle of adult yak between breeding and non-breeding seasons

季節(jié)性繁殖雄性動(dòng)物，睪丸酮在非繁殖季節(jié)減少，局部粘附分子的表達(dá)降低，同時(shí)誘導(dǎo)生殖細(xì)胞生成減少[20].研究表明，人LHR胞外區(qū)占50%以上，有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，與其所處微環(huán)境中糖蛋白生化條件密切相關(guān)[21 ].研究表明，小鼠在試驗(yàn)性長(zhǎng)距離運(yùn)輸后，睪丸中睪酮水平下降，精子數(shù)量減少，但是LHR表達(dá)增加，可能影響了精子的生成[22].本研究中繁殖間期牦牛睪丸間質(zhì)組織以酸性粘多糖陽性表達(dá)為主，LHR表達(dá)量明顯增加，二者是否存在一定關(guān)系需進(jìn)一步研究.資料表明，LHR mRNA主要表達(dá)在日本黑熊的Leydig細(xì)胞，且隨不同繁殖季節(jié)在睪丸活躍期、退化期和復(fù)蘇期表達(dá)量逐漸增加[23].本研究中LHR在繁殖間期牦牛睪丸leydig細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，顯著強(qiáng)于繁殖期，也可能與日本黑熊的表達(dá)相一致，LHR通過對(duì)睪丸局部leydig細(xì)胞的抑制，減少睪酮分泌，由此睪丸精子生成功能亦相對(duì)降低，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

PAS和AB在成年牦牛睪丸組織分布繁殖期略強(qiáng)于繁殖間期，提示其與繁殖期生精活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)；LHR表達(dá)在睪丸以leydig細(xì)胞陽性分布為主，提示高原地區(qū)繁殖季節(jié)對(duì)LHR在leydig細(xì)胞的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用.