李環(huán)　劉曉樂(lè)　王萌熙　楊亞星　尚青　史永利

摘要：為了比較聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PEG-PCL）不同結(jié)構(gòu)共聚物納米粒的性質(zhì)，采用開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)制備PCL-PEG-PCL和mPEG-b-PCL共聚物，通過(guò)FT-IR，1H-NMR和GPC進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，利用分子自組裝技術(shù)分別形成了“蘑菇”結(jié)構(gòu)和“刷”結(jié)構(gòu)載姜黃素（CUR）納米粒共聚物，對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：CUR以無(wú)定型態(tài)存在于納米粒中，納米粒形貌為球形核殼結(jié)構(gòu)且分布均勻;受共聚物結(jié)構(gòu)的影響，“蘑菇”結(jié)構(gòu)納米粒具有較小的平均粒徑（105.71±3.20）nm、較高的載藥量和包封率;PCL-PEG-PCL納米粒表面形成了致密的PEG層，能有效防止蛋白質(zhì)吸附，在體內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性;“刷”結(jié)構(gòu)納米粒具有較低的臨界膠束濃度（CMC）和良好的緩釋性能，對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖有較高的抑制作用。因此，研究載藥納米粒可為藥物遞送系統(tǒng)的選擇以及不同結(jié)構(gòu)納米粒的臨床應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：高分子合成化學(xué);聚乙二醇-聚己內(nèi)酯;兩親性共聚物;自組裝;納米粒;CUR

中圖分類號(hào)：TQ311文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

LI Huan，LIU Xiaole，WANG Mengxi，et al.Preparation of PEG-PCL copolymer nanoparticles with different structures and their quality evaluation[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2019，40（3）：215-225.Preparation of PEG-PCL copolymer nanoparticles with different

structures and their quality evaluation

LI Huan1， LIU Xiaole1， WANG Mengxi1， YANG Yaxing2， SHANG Qing1， SHI Yongli2

（1.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China; 2. College of Pharmacy， Xinxiang Medical University， Xinxiang， Henan 453003，China）

Abstract：In order to compare the properties of polyethylene glycol-polycaprolactone（PEG-PCL）with different structures， the PCL-PEG-PCL and mPEG-b-PCL copolymers are obtained by ring-opening polymerization method and characterized by FT-IR， 1H-NMR and GPC. The curcumin-loaded nanoparticles of "mushroom" and "brush" are prepared via self-assembly method， and the properties of the two structural nanoparticles are studied. The results show that CUR is encapsulated into the nanoparticles with an amorphous state; the nanoparticles show a smooth surface with core-shell structures and good dispersibility. ?Influenced by the structure of the copolymer， the "mushroom" nanoparticles have a smaller average particle size of （105.71±3.20）nm， a higher drug loading and encapsulation efficiency. Since the surface of the PCL-PEG-PCL nanoparticles forms a dense PEG-layer， protein resistance studies show that the "mushroom" nanoparticles are good in vivo stability. "Brush" nanoparticles have a lower CMC date and better sustained release properties， and have a higher inhibitory effect on HepG-2 cancer cell proliferation. The study of drug-loaded nanoparticles can provide reference for drug delivery system selection and clinical application of nanoparticles with different structures.

Keywords：polymer synthesis chemistry; PEG-PCL; amphiphilic copolymer; self-assembly; nanoparticle; CUR

聚己內(nèi)酯（PCL）是CAROTHERS小組在1930年合成的最早的聚合物之一，具有良好的生物相容性、對(duì)疏水性物質(zhì)的滲透性和一定的微生物降解能力，目前已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)生產(chǎn)[1-3]。但PCL在體內(nèi)的生物降解速率較慢，致使其在藥物遞送方面的應(yīng)用受到限制。通過(guò)對(duì)PCL進(jìn)行改性，添加親水性嵌段制備成兩親性共聚物，可獲得更多的可降解材料，使PCL得到了有效應(yīng)用。例如：兩嵌段PCL共聚物制備方面，DEBONE等[4]以開(kāi)環(huán)聚合法合成了3種不同嵌段比的mPEG-co-PCL共聚物。研究表明，隨著疏水鏈的增加，共聚物直徑由78.82 nm增大到141.8 nm，16 h后甲氨蝶呤釋放行為受PCL降解過(guò)程的影響，PCL含量越高釋放越慢。三嵌段PCL共聚物制備方面，HU等[5]制備了不同質(zhì)量比的PCL-PEG-PCL共聚物，分別形成聚合物膠束和聚合物囊泡。研究結(jié)果表明，隨著PCL嵌段長(zhǎng)度的增加，共聚物粒徑增大，載藥量也隨之增加，并且都對(duì)EMT-6細(xì)胞有較高的攝取率。

河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)2019年第3期李環(huán)，等：不同結(jié)構(gòu)PEG-PCL共聚物納米粒的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)從文獻(xiàn)來(lái)看，PCL改性只有關(guān)于兩嵌段共聚物（如mPEG-co-PCL）或三嵌段共聚物（如PCL-PEG-PCL）不同親水-疏水嵌段比的研究，尚未見(jiàn)同時(shí)對(duì)PCL改性的兩嵌段和三嵌段共聚物之間進(jìn)行比較的報(bào)道[6-14]。不同結(jié)構(gòu)的共聚物會(huì)形成不同形態(tài)的納米粒，從而影響其制劑學(xué)性質(zhì)。筆者利用開(kāi)環(huán)聚合法制備三嵌段共聚物PCL-PEG-PCL和兩嵌段共聚物mPEG-b-PCL，采用分子自組裝方法制備了具有“蘑菇”結(jié)構(gòu)和“刷”結(jié)構(gòu)的納米粒，研究了具有不同結(jié)構(gòu)的PCL共聚物納米粒對(duì)理化性質(zhì)、體外釋放、抗蛋白吸附和細(xì)胞毒性等方面的影響。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要原料及試劑

姜黃素（AR級(jí)，北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司提供）;聚乙二醇單甲醚、聚乙二醇、辛化亞錫（AR級(jí)，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司提供）;ε-己內(nèi)酯（AR級(jí)，阿拉丁生化科技股份有限公司提供）;二氯甲烷（AR級(jí)，天津市北辰方正試劑廠提供）;四氫呋喃（AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供）;乙醚（AR級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供）;HepG-2肝癌細(xì)胞、L929鼠腎上皮細(xì)胞（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所提供）。

1.2嵌段共聚物PCL-PEG-PCL和mPEG-b-PCL的合成

PCL-PEG-PCL的合成路線如圖1 a）所示。在反應(yīng)管中加入4.0 g聚乙二醇（PEG，相對(duì)分子質(zhì)量為4 000，1 mmol）和8.0 mL（72 mmol）的ε-己內(nèi)酯。采用雪茄槍加熱熔融，待自然冷卻至室溫后加入117 μL的辛化亞錫（Sn（Oct）2），密封反應(yīng)管。用液氮除氧，抽真空，充氮?dú)?，反?fù)操作3次后，將反應(yīng)管置于140 ℃油浴加熱6 h。將粗產(chǎn)物用3 mL二氯甲烷溶解，經(jīng)冰乙醚沉淀，抽濾，得到白色固體。放入真空干燥箱常溫干燥24 h，得到9.19 g的PCL-PEG-PCL固體，收率為75.3%。

mPEG-b-PCL的合成路線如圖1 b）所示。在反應(yīng)管中加入4.0 g聚乙二醇單甲醚（mPEG，相對(duì)分子質(zhì)量為4 000，1 mmol）和4.0 mL（36 mmol）的ε-己內(nèi)酯。其余操作同上述方法，得到6.43 g的mPEG-b-PCL固體，收率為79.4%。

1.3PCL-PEG-PCL和mPEG-b-PCL的表征

1.3.1FT-IR

采用STS-135型紅外光譜儀（美國(guó)Perkin Elmer）進(jìn)行紅外掃描，范圍為400～4 000 cm-1，對(duì)特征峰進(jìn)行分析，判斷是否為預(yù)期產(chǎn)品。

1.3.21H-NMR

采用Bruker Avance AV400核磁共振波譜儀，氘代氯仿（CDCl3）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）作內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行氫譜檢測(cè)。

PCL-PEG-PCL單體物質(zhì)的量比由PEG單元3.69×10-6（f）特征峰和PCL單元4.18×10-6（a）特征峰的積分來(lái)計(jì)算，PEG和PCL的聚合度（DP）及共聚物的Mn可按式（1）計(jì)算：DPPEG=Mn.PEG/44，DPPCL=DPPEG×（A（a）m/A（f）n），Mn.PCL-PEG-PCL=Mn.PEG+DPPCL×114。（1）式中：A（a）為a特征峰的積分面積，m為相應(yīng)氫個(gè)數(shù);A（f）為f特征峰的積分面積，n為相應(yīng)氫個(gè)數(shù);114為PCL重復(fù)單元的摩爾質(zhì)量。

mPEG-b-PCL單體物質(zhì)的量比由PEG單元3.53×10-6（a+b）特征峰和PCL單元4.02×10-6（g）特征峰的積分來(lái)計(jì)算，PEG和PCL的聚合度及共聚物的Mn也按式（1）計(jì)算。

1.3.3GPC

采用Waters e2695凝膠色譜儀，以四氫呋喃（THF）為流動(dòng)相，聚苯乙烯（PS）為標(biāo)樣，溫度為30 ℃，流速為1.0 mL /min，測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量及分布。

1.4載藥納米粒的制備

稱取15 mg的CUR和100 mg的PCL-PEG-PCL，溶于4 mL的THF中。在600 r/min轉(zhuǎn)速下將上述溶液緩慢滴入100 mL超純水中，持續(xù)攪拌揮發(fā)THF。共聚物在水溶液中形成納米粒，疏水性藥物姜黃素自發(fā)地被包裹在疏水PCL層[15-16]，從而得到CUR-PCL-PEG-PCL-NPs懸浮液，再經(jīng)冷凍干燥后得到CUR-PCL-PEG-PCL-NPs固體。CUR-mPEG-b-PCL-NPs的制備方法與之相同。圖2CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-

mPEG-b-PCL-NPs自組裝制備

Fig.2Preparation scheme of CUR-PCL-PEG-PCL-NPs and

CUR-mPEG-b-PCL-NPs by self-assemblyCUR-PCL-PEG-PCL-NPs的PEG兩端固定在核殼界面，在表面形成致密“蘑菇”結(jié)構(gòu)。CUR-mPEG-b-PCL-NPs的PEG一端固定在核殼界面，在表面形成相對(duì)疏松的“刷”狀結(jié)構(gòu)。圖2是具有“蘑菇”結(jié)構(gòu)和“刷”結(jié)構(gòu)載藥納米粒的自組裝制備過(guò)程。

1.5載藥納米粒的表征

1.5.1粒徑及形貌

采用馬爾文ZS90激光粒度儀對(duì)納米粒的粒度進(jìn)行表征，采用JEM-100CXⅡ型掃描電鏡觀察形貌。取適量納米?；鞈乙海卧谔寄ゃ~網(wǎng)上，停留2 min，用磷酸鎢染色后檢測(cè)。

1.5.2DSC分析

采用DZ3335型差示掃描量熱儀測(cè)定樣品的熱性能，升溫速率為10 ℃/min，N2（40 mL/min）保護(hù)。

1.5.3臨界膠束濃度

納米粒的CMC用芘熒光探針?lè)y(cè)定，CMC值越低，溶液越穩(wěn)定。配制濃度為6×10-4 mol/L的芘-丙酮溶液100 mL，以1.0 mg/mL載藥納米粒溶液作為母液，稀釋配制成11個(gè)不同濃度的納米粒溶液，備用。準(zhǔn)備11個(gè)10 mL容量瓶，分別加入10 μL的芘-丙酮溶液，于50 ℃鼓風(fēng)干燥揮發(fā)丙酮，并用上述不同濃度的納米粒溶液分別定容，芘的終濃度保持為6×10-7 mol/L。在65 ℃恒溫水浴下振蕩1 h（轉(zhuǎn)速為110 r/min），于室溫避光過(guò)夜。用RF-5301pc熒光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為333 nm，檢測(cè)范圍為350～450 nm，記錄373 nm和384 nm的熒光強(qiáng)度I373和I384，以I373/I384為縱坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。

1.5.4包封率和載藥量

稱取0.01 g的CUR，放入10 mL的容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解定容為1.0 mg/mL的母液，將母液稀釋成不同濃度CUR的無(wú)水乙醇溶液，測(cè)定熒光度（激發(fā)波長(zhǎng)為442 nm，檢測(cè)范圍為455～700 nm），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密量取用母液溶劑無(wú)水乙醇配制的納米粒混懸液（1 mg/mL），放入離心管中，離心沉淀。取上清液1.0 mL，放入10 mL的容量瓶?jī)?nèi)，用配制母液時(shí)的溶劑無(wú)水乙醇稀釋定容，0.22 μm濾頭過(guò)濾。取濾液測(cè)其熒光度，計(jì)算游離CUR的量，記為W1。洗滌離心沉淀物，真空冷凍干燥，稱定質(zhì)量，記為W。另取無(wú)水乙醇納米粒溶液1.0 mL，放入10 mL的容量瓶?jī)?nèi)，用配制母液時(shí)的溶劑無(wú)水乙醇稀釋定容，超聲，0.22 μm濾頭過(guò)濾。取濾液測(cè)定其熒光度，計(jì)算總藥物量，記為W0，按式（2）計(jì)算包封率和載藥量。包封率=（W0-W1）/W0，載藥量=（W0-W1）/W。（2）1.5.5載藥納米粒體外釋放

分別稱取15 mg的CUR原料藥與2種載藥納米粒凍干粉，分散于15 mL釋放介質(zhì)（pH值為7.4的磷酸緩沖溶液/乙醇，二者體積比為2∶1）中。取上述溶液各5 mL，分別放入3個(gè)透析袋中，扎好后分別放入含有30 mL釋放介質(zhì)的離心管中，放入恒溫水?。?00 r/min，（37±0.5）℃）中，在不同時(shí)間取樣（每次取15 mL透析液，0.22 μm濾頭過(guò)濾，補(bǔ)液15 mL），采用熒光分度計(jì)測(cè)定CUR含量，計(jì)算累積釋放度。

1.5.6抗蛋白吸附

將20 mg納米粒凍干粉加入至20 mL pH值為7.4的磷酸緩沖液中，超聲分散成透明懸浮液，檢測(cè)其0 h的初始粒徑。加入2 mL小牛血清超聲30 s，混勻后測(cè)量不同時(shí)間的粒徑分布，觀察載藥納米粒的抗蛋白吸附情況。

1.5.7細(xì)胞毒性

取HepG-2和L929細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、洗滌、離心后制備成2.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，在37 ℃含有5% CO2的100 μL DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)基，添加100 μL不同濃度的CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs溶液。將培養(yǎng)在DMEM中的細(xì)胞作為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后移除培養(yǎng)基，添加100 μL DMEM培養(yǎng)基和20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后除去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO待其完全溶解，振蕩培養(yǎng)板均勻染色。采用Bio-RAD 680酶聯(lián)檢測(cè)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2結(jié)果與討論

2.1.1FT-IR

PCL-PEG-PCL和mPEG-b-PCL的紅外光譜圖見(jiàn)圖3。

由圖3可知，2種聚合物表現(xiàn)出類似的特征峰，3 537 cm-1為ε-己內(nèi)酯開(kāi)環(huán)聚合后末端—OH吸收峰，1 724 cm-1為PCL嵌段—C=O吸收峰，1 120 cm-1為PEG嵌段中—O—吸收峰，不同的是mPEG-b-PCL在1 380 cm-1處有—CH3吸收峰。由紅外初步確定，ε-己內(nèi)酯開(kāi)環(huán)聚合和PEG生成兩親性嵌段共聚物。

2.1.2PCL-PEG-PCL和mPEG-b-PCL 1H-NMR分析

PCL-PEG-PCL的1H-NMR譜圖見(jiàn)圖4，mPEG-b-PCL的1H-NMR譜圖見(jiàn)圖5。

圖4中b是ε-己內(nèi)酯開(kāi)環(huán)聚合后形成的—CH2—CH2—CH2—特征峰，2.39×10-6 （c），4.18×10-6 （a）分別是PCL嵌段的—O—CH2—和—CH2—CO—特征峰;369×10-6 （f）是PEG嵌段中的—O—CH2—CH2—O—特征峰;而4.25×10-6 （d）和3.80×10-6 （e）是由PCL和PEG兩嵌段銜接處的—CO—O—CH2（d）—CH2（e）—O—CH2—特征峰，說(shuō)明ε-己內(nèi)酯發(fā)生開(kāi)環(huán)聚合，并和PEG生成PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物。PCL與PEG單體物質(zhì)的量比為0.59，聚合度DPPEG為91，DPPCL為54，共聚物的Mn為10 156，共聚物嵌段為PCL27-PEG91-PCL27。

從圖4可以看出，以重水為溶劑和以氯仿為溶劑的核磁共振氫譜呈現(xiàn)的特征峰基本一致，但以重水為溶劑的核磁共振氫譜中a，c，b處的峰強(qiáng)度有所減弱。因?yàn)镻CL-PEG-PCL在水中形成了納米粒，疏水端（PCL）自組裝成了內(nèi)核，被親水端（PEG）包裹，而使強(qiáng)度減弱。這也說(shuō)明了PCL-PEG-PCL在水中具有良好的自組裝成納米粒的性質(zhì)。

圖5為mPEG-b-PCL的核磁共振氫譜，1.34×10-6 （e），1.58×10-6 （d+f），2.39×10-6 （c）和4.02×10-6 （g）峰分別是PCL嵌段—CO—CH2（c）—CH2（d）—CH2（e）—CH2（f）—CH2（g）—O—特征峰;3.53×10-6 （a + b）是mPEG的—CH2—CH2—特征峰。由圖5可知，氫譜表現(xiàn)出的特征峰與mPEG-b-PCL結(jié)構(gòu)一致，說(shuō)明ε-己內(nèi)酯發(fā)生了開(kāi)環(huán)聚合，生成mPEG-b-PCL。PCL與PEG單體物質(zhì)的量比為0.33，聚合度DPmPEG為91，DPPCL為30，共聚物的Mn為7 420，共聚物為mPEG91-b-PCL30。由GPC測(cè)定的聚合物的數(shù)均分子質(zhì)量Mn.GPC比較接近于由核磁測(cè)定的分子質(zhì)量。

2.1.3PCL-PEG-PCL和mPEG-b-PCL GPC凝膠色譜分析

從圖6、圖7可以看出，聚合物呈單峰分布且分布較窄，說(shuō)明純化后已除去所有雜質(zhì)，不是PEG/PCL和mPEG/PCL的共混物，證明制得了目標(biāo)嵌段共聚物。其分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布如表1所示。

2.2載藥納米粒的表征

2.2.1粒徑及形貌

CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs的直徑粒徑分布圖見(jiàn)圖8。由圖8可知，CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs的粒徑分布主要在100 nm左右，平均粒徑（d）分別為（105.71±3.20）nm和（122.42±2.13）nm，多分散指數(shù)分別為（0.187±0.66）和（0.112±0.07）。較小的粒徑和多分散指數(shù)，可以避過(guò)Kupffer細(xì)胞的吞噬，降低納米粒被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）識(shí)別和攝取的機(jī)會(huì)，增強(qiáng)滲

注：a和b為粒度儀檢測(cè)報(bào)告粒徑圖

圖8CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs的直徑粒徑分布圖

Fig.8Diameter particle size distribution of CUR-PCL-PEG-PCL-NPs and CUR-mPEG-b-PCL-NPs

透滯留（EPR）效應(yīng)[17]。結(jié)果表明，三嵌段共聚物納米粒平均粒徑略小，因?yàn)槿抖喂簿畚镒越M裝過(guò)程會(huì)經(jīng)過(guò)“彎曲”形成“蘑菇”狀納米粒，而兩嵌段納米粒無(wú)此過(guò)程，直接形成“刷”狀納米粒，提供的立體結(jié)構(gòu)比較大。

兩親性嵌段共聚物可以在水溶液中進(jìn)行自組裝形成親水性的殼PEG和疏水性的核PCL。如圖9所示，TEM直觀顯示了2種共聚物納米粒為球形核殼結(jié)構(gòu)，且表面光滑，分散性良好，粒徑大小與激光粒度儀測(cè)定的數(shù)據(jù)結(jié)果接近。

2.2.2DSC分析

納米粒子中藥物的結(jié)合狀態(tài)是決定藥物釋放特性的重要因素。圖10顯示了CUR、兩種聚合物及聚合物載藥納米粒的DSC曲線。CUR在175 ℃有一個(gè)晶體熔融的吸熱峰，說(shuō)明CUR是結(jié)晶性藥物。而CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs在175 ℃左右并沒(méi)有出現(xiàn)晶體熔融吸收峰，分別只有一個(gè)特征峰，反映的是PCL-PEG-PCL和mPEG-b-PCL的玻璃化轉(zhuǎn)變過(guò)程中的吸熱峰，說(shuō)明CUR在聚合物基質(zhì)中呈無(wú)定型狀態(tài)，無(wú)定型藥物溶解時(shí)不需要克服結(jié)晶能，有利于藥物釋放發(fā)揮藥效。

2.2.3臨界膠束濃度

CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs的CMC圖見(jiàn)圖11。

圖11CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs的CMC圖

Fig.11CMC value of ?CUR-PCL-PEG-PCL-NPs and CUR-mPEG-b-PCL-NPs

芘溶液的熒光發(fā)射光譜特征峰分別在373，379，384，394，480 nm附近，第一與第三發(fā)射峰強(qiáng)度比值I1/I3（即I373/I384）會(huì)隨著溶液極性的減小而下降。在超過(guò)CMC后，I373/I384曲線會(huì)發(fā)生突變，突變點(diǎn)為其CMC值。由圖11可得到CUR-PCL-PEG-PCL-NPs的CMC為4.6×10-3 mg/mL，CUR-mPEG-b-PCL-NPs的CMC為1.4×10-3 mg/mL。結(jié)果顯示，兩嵌段共聚物納米粒具有較低的CMC值，CMC值的大小受疏水鏈段長(zhǎng)度和親水鏈段的影響，疏水鏈段差異較小時(shí)，CMC主要受親水基團(tuán)的影響，三嵌段共聚物親水鏈段處于共聚物中間位置而使得其CMC增大，因此“刷”狀納米粒表現(xiàn)出更優(yōu)異的抗稀釋穩(wěn)定性。

2.2.4包封率和載藥量測(cè)定

將樣品的吸光度值與對(duì)應(yīng)的CUR質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖12所示?；貧w方程為y=13952x+9.86，R2=0.999 6，說(shuō)明CUR質(zhì)量濃度在05～5.0 μg/mL之間，質(zhì)量濃度與吸光度的相關(guān)性良好。表2列出了2種納米粒在不同投料比下的載藥量和包封率。隨著投料比的增加，載藥量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。這表明當(dāng)CUR達(dá)到聚合物基質(zhì)中的飽和度后，過(guò)多的藥物會(huì)影響納米粒的整體穩(wěn)定性，導(dǎo)致載藥量降低。實(shí)驗(yàn)中選擇15∶100的投料比。三嵌段共聚物納米粒載藥量、包封率要大于兩嵌段共聚物納米粒，這點(diǎn)與CMC契合，其包含更多的共聚物，即疏水性嵌段PCL的含量越高，載藥量也隨之增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

2.2.5負(fù)載CUR的NPs凍干粉的體外釋放

CUR，CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs的體外釋放曲線如圖13所示。

由圖13可知，在體外釋放研究中，CUR原料藥在釋放介質(zhì)中釋放較快，在5 h內(nèi)幾乎完全釋放，累積釋放度為（94.8±1.2）%。CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs 24 h后的累積釋放度為（74.32±1.98）%和（58.13±2.70）%，兩種結(jié)構(gòu)納米粒均具有明顯的緩釋特征。這是因?yàn)樗幬镓?fù)載到聚合物載體后擴(kuò)散到溶液的速度變慢，因而釋放周期延長(zhǎng)[18]。“蘑菇”納米粒CUR釋放速率要高于“刷”納米粒，是因?yàn)槠渚哂休^小粒徑、較高載藥量，因此兩嵌段共聚物制備的“刷”納米粒表現(xiàn)出更持久的釋放模式。

2.2.6負(fù)載CUR的NPs凍干粉的體外釋藥模型擬合

按零級(jí)、一級(jí)、Higuchi方程對(duì)載藥納米粒體外釋放進(jìn)行擬合，以取樣時(shí)間（t）的平方根為橫軸，以累積釋放度為縱坐標(biāo)對(duì)Higuchi方程進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)圖14。

R2越接近于1，擬合程度越好。由圖14可知，2種載藥納米粒的體外釋放一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合效果最好，表示能持續(xù)緩慢釋放藥物。Higuchi模型用來(lái)衡量緩釋性能，由R2可知，兩嵌段“刷”納米粒具有更好的緩釋性能。

2.2.7抗蛋白吸附

載藥納米?？沟鞍孜搅綀D如圖15所示。

由圖15可知，模擬人體微環(huán)境中，10 h內(nèi)納米粒的粒徑均有明顯的增大趨勢(shì)，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種趨勢(shì)趨于平緩，說(shuō)明CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs在體內(nèi)具有一定的抗蛋白吸附特性，可減少體內(nèi)系統(tǒng)清除，延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間。另外，三嵌段“蘑菇”納米粒的粒徑變化相對(duì)平穩(wěn)，具有更好的抗蛋白吸附特性。研究表明，納米粒殼層PEG的親水性是具有抗吸附能力的重要原因[19]。蛋白吸附因疏水基相互靠攏而產(chǎn)生，在蛋白質(zhì)與疏水基間加入親水基團(tuán)而產(chǎn)生排斥作用，從而抑制吸附的產(chǎn)生[20]。PEG提供較大的空間位阻，有利于將產(chǎn)生吸附的物質(zhì)阻隔在距離基質(zhì)表面較遠(yuǎn)的位置，進(jìn)一步控制吸附的發(fā)生。PEG層的抗蛋白能力不僅取決于PEG的長(zhǎng)度和密度，更取決于納米粒的結(jié)構(gòu)。與二嵌段“刷”納米粒相比，三嵌段“蘑菇”納米粒形成了更致密的PEG層，從而具有更優(yōu)異的抗蛋白吸附特性。

2.2.8細(xì)胞毒性

用MTT法檢測(cè)載藥納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的毒性，如圖16所示。CUR-PCL-PEG-PCL-NPs和CUR-mPEG-b-PCL-NPs對(duì)HepG-2細(xì)胞具有一定細(xì)胞毒性（見(jiàn)圖16 a）），并呈現(xiàn)良好的質(zhì)量濃度依賴性，這說(shuō)明載藥納米粒保持了原有藥物的作用機(jī)制和藥效，給藥越多，抑制效果越好，由體外釋放可知，該前藥具有持續(xù)的抗腫瘤效果。質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL時(shí)，2種納米粒對(duì)HepG-2的細(xì)胞毒性相似，隨著質(zhì)量濃度的增加，“刷”納米粒表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。雖然“蘑菇”納米粒具有較高的釋放量，但其表面存在致密的PEG層，高的PEG表面密度對(duì)細(xì)胞吸附的排斥影響比PEG鏈長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞吸附的排斥影響大[21]，因此“刷”納米粒會(huì)吸附更多的HepG-2細(xì)胞，意味著姜黃素被更多的細(xì)胞吞噬，從而“刷”納米粒具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。與HepG-2癌細(xì)胞相比，載藥納米粒對(duì)L929正常細(xì)胞的毒性明顯降低（見(jiàn)圖16 b））。癌細(xì)胞對(duì)納米粒的胞吞能力要優(yōu)于正常細(xì)胞，其生長(zhǎng)促進(jìn)基因、轉(zhuǎn)錄基因等表達(dá)強(qiáng)烈于正常細(xì)胞;而CUR納米粒只對(duì)表現(xiàn)異?；钴S的基因產(chǎn)生嵌合作用，這種嵌合作用能作用于所有癌細(xì)胞，而不會(huì)作用于正常細(xì)胞。這就是CUR納米粒能準(zhǔn)確“識(shí)別”癌細(xì)胞的原因。

3結(jié)論

1） 采用分子自組裝法制備了PEG-PCL“蘑菇”納米粒和“刷”納米粒，結(jié)果表明，不同結(jié)構(gòu)的納米粒對(duì)其制劑學(xué)性質(zhì)有不同影響。

2） 納米粒呈球形核殼結(jié)構(gòu)，粒徑分布均勻，藥物以無(wú)定型態(tài)被包裹在共聚物內(nèi)，有利于藥物的釋放。

3） 受共聚物結(jié)構(gòu)的影響，三嵌段“蘑菇”納米粒在自組裝中經(jīng)過(guò)“彎曲”過(guò)程，具有較小的平均粒徑（（105.71±3.20）nm），在載藥量和包封率、體外釋放方面也表現(xiàn)出更好的效果，其致密的PEG層能夠有效防止蛋白質(zhì)吸附。

4） 兩嵌段“刷”納米粒具有較低的CMC和更好的緩釋性能，對(duì)HepG-2具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。但由于制備的納米粒載藥量較低，當(dāng)負(fù)載藥物達(dá)到飽和時(shí)，隨著投料比的增加載藥量反而會(huì)降低。今后應(yīng)進(jìn)一步研究如何提高納米粒的載藥量，提升載藥納米粒的體內(nèi)抗腫瘤效果，為不同結(jié)構(gòu)納米粒的臨床應(yīng)用提供參考。

參考文獻(xiàn)/References：

[1]WOODRUFF M A， HUTMACHER D W. The return of a forgotten polymer： Polycaprolactone in the 21st century[J]. Progress in Polymer Science， 2010， 35（10）：1217-1256.

[2]WEI Xiawei， GONG Changyang， GOU Mali， et al. Biodegradable poly（epsilon-caprolactone）-poly（ethylene glycol） copolymers as drug delivery system[J]. International Journal of Pharmaceutics， 2009， 381（1）：1-18.

[3]CATAURO M， BOLLINO F， PANALE F， et al. Modulation of indomethacin release from ZrO2/PCL hybrid multilayers synthesized via sol-gel dip coating[J]. Journal of Drug Delivery Science and Technology， 2015， 26：10-16.

[4]DEBONE P R， VICTOR B J， GOMIDES G G， et al. mPEG-co-PCL nanoparticles： The influence of hydrophobic segment on methotrexate drug delivery[J]. Colloids and Surfaces A： Physicochemical and Engineering Aspects， 2018， 555：142-149.

[5]HU Chunyan， CHEN Zhuo，WU Shengjie， et al. Micelle or polymersome formation by PCL-PEG-PCL copolymers as drug delivery systems[J]. Chinese Chemical Letters， 2017（9）：117-121.

[6]AZOUA L， DAHMOUNE F， REZGUI F， et al. Full factorial design optimization of anti-inflammatory drug release by PCL-PEG-PCL microspheres[J]. Materials Science and Engineering C， 2016， 58：412-419.

[7]ALI R， FARAH A， BINKHATHLAN Z. Development and characterization of methoxy poly（ethylene oxide）-?block -poly（ε-caprolactone） （PEO-?b -PCL） micelles as vehicles for the solubilization and delivery of tacrolimus[J]. Saudi Pharmaceutical Journal， 2017，25（2）：258-263.

[8]TIWARI A， PRABAHARAN M. An amphiphilic nanocarrier based on guar gum-graft-poly（ε-caprolactone） for potential drug-delivery applications[J]. Journal of Biomaterials Science，2010， 21（6/7）：937-949.

[9]DUAN Kongrong， ZHANG Xiaolan， TANG Xiaoxing，et al. Fabrication of cationic nanomicelle from chitosan-graft-polycaprolactone as the carrier of 7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin[J]. Colloids & Surfaces B： Biointerfaces， 2010， 76（2）：475-482.

[10]BARTOLOZZI I， SOLARO R， SCHACHT E， et al. Hydroxyl end-capped macromers of N-vinyl-2-pyrrolidinone as precursors of amphiphilic block copolymers[J]. European Polymer Journal， 2007， 43（11）：4628-4638.

[11]WILSON D R， ZHANG N， SILVERS A L， et al. Synthesis and evaluation of cyclosporine A-loaded polysialic acid-polycaprolactone micelles for rheumatoid arthritis[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences， 2014， 51：146-156.

[12]LEE Y S， KIM H J， YANG D H， et al. Preparation and anticancer activity evaluation of self-assembled paclitaxel conjugated MPEG-PCL micelles on 4T1 cells[J].Journal of Industrial and Engineering Chemistry， 2019，71：369-377.

[13]SHI Chunhuan， ZHANG Zhiqing， SHI Jiaxing， et al. Co-delivery of docetaxel and chloroquine via PEO-PPO-PCL/TPGS micelles for overcoming multidrug resistance[J]. International Journal of Pharmaceutics， 2015， 495（2）：932-939.

[14]齊旭， 劉佩， 李速明， 等. 聚乳酸-聚乙二醇三嵌段共聚物包載紫杉醇納米膠束的制備及其體外藥物釋放行為[J].復(fù)旦大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2013， 52（1）：1-8.

QI Xu， LIU Pei， LI Suming， et al. Preparation and drug release behavior of paclitaxel loaded polylactide-poly （ethylene glycol） triblock copolymer micelles[J]. Journal of Fudan University（Natural Science）， 2013， 52（1）：1-8.

[15]孫菁， 蔣新國(guó)， 李端， 等. 一種包載難溶性抗腫瘤藥物的聚合物膠束凍干制劑[P]. 中國(guó)專利：CN 102218027， 2011-10-19.

[16]CARAGLIA M， MARRA M， MISSO G， et al. Tumour-specific uptake of anti-cancer drugs： The future is here[J]. Current Drug Meta-bolism， 2012， 13（1）：4-21.

[17]TRIOLO D， CRAPARO E F， PORSIO B， et al. Polymeric drug delivery micelle-like nanocarriers for pulmonary administration of beclomethasone dipropionate[J]. Colloids and Surfaces B： Biointerfaces， 2017， 151：206-214.

[18]CHEN Shenfu， LI Lingyan， ZHAO Chao， et al. Surface hydration： Principles and applications toward low-fouling/nonfouling biomaterials[J]. Polymer， 2010，51（23）：5283-5293.

[19]肖錫峰， 江小群， 周雷激， 等. 聚乙二醇表面改性抑制蛋白質(zhì)非特異性吸附[J]. 分析化學(xué)， 2013， 41（3）：445-453.

XIAO Xifeng， JIANG Xiaoqun， ZHOU Leiji， et al. Surface modification of poly ethylene glycol to resist nonspecific adsorption of proteins [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry，2013， 41（3）：445-453.

[20]YANG Y， SHI D， WANG X， et al. Preparation of poly（cyclooctene）-g-poly（ethylene glycol） （PCOE-g-PEG） graft copolymers with tunable PEG side chains via ROMP and its protein adsorption and platelet adhesion properties[J]. Materials Science Engineering C，2014， 45：539-545.

[21]JEON S I， ANDRADE J D. Protein-surface interactions in the presence of polyethylene oxide（Ⅱ）：Effect of protein size[J]. Journal of Colloid and Interface Science， 1991， 142（1）：159-166.第40卷第3期河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)Vol.40，No.3

2019年6月Journal of Hebei University of Science and TechnologyJune 2019