劉魯峰 寸海春 何鵬飛 狄義寧 吳毅歆 何麗蓮 李富生 何月秋

摘 ?要 ?為探究甘蔗內(nèi)生菌多樣性組成及相關(guān)特性，本研究采用稀釋涂板法分離并結(jié)合形態(tài)觀察和分子標(biāo)記（gyrB， rpoB， ITS， 16S rDNA）進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，從12個(gè)栽培品種（系）和5個(gè)野生種無性系的根、莖、葉組織中共分離到細(xì)菌589株、放線菌34株和真菌46株;細(xì)菌中固氮菌有41株，溶磷菌有98株，解鉀菌有52株，對(duì)黃曲霉和禾谷鐮刀菌具有拮抗作用分別有44株和35株。內(nèi)生細(xì)菌分屬21個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬為優(yōu)勢屬;內(nèi)生真菌分屬于枝頂孢屬、鏈格孢屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、枝孢屬等17個(gè)屬，而放線菌僅為鏈霉菌屬。具有潛在植物益生功能的菌株主要集中在芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、類芽孢桿菌屬及泛菌屬。本研究顯示甘蔗栽培品種（系）和野生種無性系均含有豐富的內(nèi)生菌資源，且栽培品種（系）所含內(nèi)生菌在數(shù)量和多樣性上均高于野生種無性系;12個(gè)栽培品種（系）間所分離到的內(nèi)生細(xì)菌大部分相同，但也存在差異。通過初步的功能鑒定，篩選出一些具有應(yīng)用潛力的益生微生物，為開發(fā)相應(yīng)功能的生物菌劑奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ?甘蔗;內(nèi)生菌;分離;鑒定;功能多樣性

中圖分類號(hào) ?S566.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?To investigate the diversity composition of sugarcane endophytes and the beneficial characteristics， dilution-plating， morphological observation and molecular marker （gyrB [gyrase beta-subunit]， rpoB [RNA polymerase beta-subunit]， ITS [integrated transcribed space]， 16S rDNA） were used in the combination and several room assays such as phosphate-， potassium-solubilizations and antagonistism tests. The results showed that 589 bacterial， 34 actinomycetic and 46 fungal strains were isolated from the root， stem and leaf tissues of 12 sugarcane varieties and 5 wild species， of which 41 strains could fix nitrogen， 98 and 52 strains solubilize phosphate and potassium respectively， 44 and 35 strains were antagonistic to Aspergillus flavus and Fusarium graminearum， respectively. The endophytic bacteria belonged to 21 genera， among them Bacillus， Burkholderia， Enterobacter and Pantoea were the dominant. The endophytic fungi were classified into 17 genera， Acremonium， Alternaria， Aspergillus， Ceriporia， Cladosporium， etc.， while actiomycetes was Streptomyces only. The strains with plant beneficial potentials were mainly clustered into Bacillus， Burkholderia， Enterobacter， Pseudomonas， Acinetobacter， Paenibacillus and Pantoea. The study showed rich endophyte resources both in the sugarcane varieties and wild species interior， and the number and diversity of endophytes in the cultivated varieties were higher than that of wild species. Most of the endogenous bacteria isolated from 12 sugarcane cultivars were the same， but there were differences. Through preliminary functional identification， some probiotics with application potential were screened out， which laid a foundation for the development of biological agents with corresponding functions.

Keywords ?sugarcane; endophytic microbe; isolation; identification; functional diversity

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.016

植物內(nèi)生菌是指生活史中某一段生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物沒有明顯病害癥狀的一類微生物，主要包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌[1-2]。19世紀(jì)中期，人們就開始了對(duì)植物內(nèi)生菌的初步探索和研究，直到1977年Bacon等發(fā)現(xiàn)高羊茅內(nèi)生真菌與牛的中毒癥狀有關(guān)之后[3]，植物內(nèi)生菌的研究工作才引起廣泛的關(guān)注。特別是1993年Stierle首次報(bào)道了從短葉紫杉的韌皮部分中分離出一株內(nèi)生真菌（Taxomyces andreanae）能產(chǎn)生紫杉醇[4]，再次掀起了研究植物內(nèi)生菌的熱潮。目前各國科研人員已在80多個(gè)屬中290多種禾本科植物發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生菌，在農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物中的內(nèi)生細(xì)菌已超過129種，54個(gè)屬被報(bào)道，發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌主要集中在芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）等[5]。內(nèi)生真菌則主要集中在子囊菌類（Ascomycet）及其無性型[6]，內(nèi)生放線菌則以鏈霉菌屬（Streptomyces）、諾氏卡菌屬（Nocardia）、小單胞菌屬（Micromonospora）為主[7]。

植物內(nèi)生菌可以通過提高營養(yǎng)物質(zhì)及礦物質(zhì)的循環(huán)利用促進(jìn)植物生長，改善土壤條件，提高化肥利用率，保護(hù)植物免受病原菌的侵害。目前研究表明植物內(nèi)生菌具有固氮、溶磷和解鉀功能，尤其是固氮作用研究較多，而內(nèi)生固氮菌多為內(nèi)生固氮細(xì)菌，大多分離自健康植物組織器官中，主要包括固氮螺菌（Azospirillum spp.）、重氮營養(yǎng)醋桿菌（Acetobacter diazotrophicus）、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、克雷伯氏菌（Klebsiella spp.）、成團(tuán)腸桿菌（Enterobacter agglomerans）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、草螺菌（Herbaspirillum spp.）、固氮弧菌（Azoarcus spp.）、糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia spp.）等[8]。而溶磷和解鉀微生物更多的是從植物根際土壤中進(jìn)行篩選分離得到，從植物中分離溶磷和解鉀內(nèi)生菌的研究相對(duì)較少。Chen等[9]從北京官廳水庫的水生植物蘆葦、菹草、睡蓮和茨藻中分離獲得了36株具有溶磷作用的細(xì)菌;郭瑩等[10]從寒區(qū)富營養(yǎng)化水體中的健康穗花狐尾藻植株內(nèi)分離獲得了一株具有溶磷作用的沙雷氏菌屬內(nèi)生菌SP5。有時(shí)也能分離到兼具固氮溶磷解鉀的多功能菌株，如陽潔等[11]從廣西藥用野生稻（Oryza officinalis）中篩選出4株具有高效溶磷解鉀的內(nèi)生固氮菌。

植物內(nèi)生菌在拮抗病原菌方面的研究也取得了長足進(jìn)展。Strobel團(tuán)隊(duì)和Li團(tuán)隊(duì)分別證實(shí)了從雷公藤分離到的內(nèi)生真菌Cryptosporiopsis cf. quercina對(duì)核盤菌、灰葡萄孢和稻瘟病菌等多種植物病原微生物有拮抗作用[12-13]。何紅等從辣椒中分離到的108株內(nèi)生細(xì)菌有約1/4的菌株對(duì)香蕉枯萎病菌、黃瓜枯萎菌有拮抗作用，其中1株枯草芽孢桿菌對(duì)植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等有強(qiáng)烈的抑制作用[14-15]。袁軍等從馬鈴薯中分離到40株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)環(huán)腐病菌有不同程度的拮抗作用[16]。Mitchell等從野生鳳梨中分離的內(nèi)生真菌Muscodor crispans不僅對(duì)植物病原菌腐霉、樟疫霉、核盤菌、球腔菌有抗菌活性，對(duì)人的病原菌鼠疫桿菌、結(jié)核分枝桿菌和葡萄球菌也有抗菌活性[17]。王霞等從植物菘藍(lán)中對(duì)分離到4株對(duì)植物病原菌禾谷鐮刀菌、鏈格孢霉、大斑凸臍蠕孢有很強(qiáng)拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌[18]。研究人員還從棉花、大蒜、酸棗等植物中分離到大量對(duì)病原菌有拮抗作用的內(nèi)生菌。

甘蔗是重要的糖料作物和能源作物，甘蔗內(nèi)生菌最早發(fā)現(xiàn)于1961年，迄今已有10種以上的內(nèi)生菌種屬在美洲、澳洲和亞洲甘蔗體內(nèi)被分離，國內(nèi)外甘蔗內(nèi)生菌研究大部分集中在固氮菌方面[19-21]，與甘蔗有關(guān)的溶磷解鉀菌大多分離自甘蔗根際土壤[22]。學(xué)者們主要從甘蔗的根際土或根或莖葉中分離甘蔗內(nèi)生細(xì)菌[23-25]，對(duì)于甘蔗內(nèi)生真菌及放線菌的分離研究較少，同時(shí)從甘蔗野生種及栽培種分離內(nèi)生菌鮮有報(bào)道。我國甘蔗內(nèi)生菌相關(guān)研究起步較晚，迄今為止未分離到適合我國生態(tài)條件下的穩(wěn)定高效甘蔗內(nèi)生菌互作模式菌株，而從國外引進(jìn)的具良好特性的甘蔗品種在我國種植也難以獲得在其原產(chǎn)地同樣的高促生效率[26]。因此本研究從12個(gè)栽培品種（系）及5個(gè)野生種無性系的根、莖、葉中分離內(nèi)生真菌、細(xì)菌、放線菌，并對(duì)分離到的內(nèi)生菌進(jìn)行分子鑒定，初步探討甘蔗野生種及栽培種根、莖、葉部內(nèi)生菌的多樣性，并獲得具有應(yīng)用價(jià)值的益生微生物，為后續(xù)甘蔗的病蟲害防治以及促生抗逆提供優(yōu)良的菌種資源儲(chǔ)備。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

植物材料：12個(gè)甘蔗栽培品種/系——新臺(tái)糖10、新臺(tái)糖22、粵糖86-368、粵糖93-359、桂糖11、云蔗99-91、閩糖69-421、崖城89-9、滇蔗01-47、滇蔗01-58、滇蔗04-14、滇蔗09-38，代號(hào)分別設(shè)為ROC10、ROC22、YT86、YT93、GT11、YZ99、MT69、YC89、DZ47、DZ58、DZ14、DZ38;5個(gè)甘蔗野生資源無性系——割手密（Saccharum ?spontaneum）、斑茅（Saccharum arundinaceum）、蔗茅（Erianthus fulvus）、五節(jié)芒（Miscanthus floridulus）、河八王（Saccharum narenga），代號(hào)分別設(shè)為SS、SA、EF、MF、SN。這些材料均種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所資源圃。

菌株：植物病原真菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）及黃曲霉菌（Aspergillus flavus）、洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）1-2菌株，均保存于本實(shí)驗(yàn)室。

培養(yǎng)基：LB固體及液體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基[27]、察氏（Czapek）培養(yǎng)基[27]、NBRIP培養(yǎng)基[10]、Pikovskaya（簡稱PVK）培養(yǎng)基[28]、Ashby無氮培養(yǎng)基[29]及Aleksandrov培養(yǎng)基[30]分別用于細(xì)菌、真菌及放線菌分離擴(kuò)繁，以及解無機(jī)磷、固氮、解鉀和拮抗試驗(yàn)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?內(nèi)生菌的分離純化及形態(tài)觀察 ?采用研磨稀釋涂板法分離不同甘蔗品種和野生無性系植株健康組織內(nèi)部的微生物。從一年生宿根甘蔗分蘗期植株上分別剪取健康的根、莖及葉組織，用毛筆輕輕刷除其上所附著的土壤顆粒，隨后使用自來水沖洗2～3 min以去除表面多余的雜質(zhì)，濾紙吸干表面水分。取上述預(yù)處理過的各組織1.0 g，用75%酒精浸泡根組織3 min，莖、葉組織1 min;再用1% NaClO溶液消毒根組織6 min，莖、葉組織3 min;再用無菌水各漂洗6次以除去消毒劑;最后使用無菌濾紙吸干殘留的水分。吸取最后一次漂洗的無菌水100 μL涂布于PDA、LB和高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，驗(yàn)證消毒效果。將消毒好的組織樣品放入無菌研缽中，并向其內(nèi)加入9 mL無菌水，研磨至成勻漿狀，然后10倍梯度稀釋，取一定體積的適當(dāng)梯度稀釋液至PDA、LB和高氏一號(hào)固體培養(yǎng)平板上，均勻涂布，最后置于適宜的溫度下培養(yǎng)。挑選菌落形態(tài)不同的單菌落純化，并將形態(tài)大部分相似的菌落劃歸為同一類，保存菌株備用。

1.2.2 ?具有溶磷、解鉀或固氮活性內(nèi)生細(xì)菌的平板篩選 ?從–80?℃冰箱中取出內(nèi)生細(xì)菌的甘油貯液，室溫放置，待其呈熔融狀態(tài)。在超凈臺(tái)上用無菌牙簽蘸取少許甘油菌液，分別點(diǎn)接于無氮Ashby、PVK溶磷或解鉀固體平板上，置于30?℃恒溫箱中倒扣培養(yǎng)4～5?d;以溶磷細(xì)菌洋蔥伯克霍爾德氏菌1-2菌株為正對(duì)照，觀察菌落周圍有無水解圈的出現(xiàn)，測量菌落直徑的大小并將其與對(duì)照菌株作比較，初步判斷內(nèi)生細(xì)菌的固氮、溶磷及解鉀能力，并做好相關(guān)記錄和拍照留存。

1.2.3 ?拮抗禾谷鐮刀和黃曲霉菌的內(nèi)生細(xì)菌篩選 ?（1）平板點(diǎn)菌初篩。從–80?℃冰箱中取出粘有禾谷鐮刀菌菌絲或黃曲霉菌分生孢子的濾紙片，分別置于PDA平板中央，25～28?℃培養(yǎng)3～5 d以活化病原真菌;使用無菌接種針在活化菌落的邊緣挑取含有菌絲的瓊脂塊，轉(zhuǎn)接于盛有20 mL液體Czapek培養(yǎng)基的50 mL規(guī)格三角瓶中，28?℃，150 rpm振搖培養(yǎng)5 d;血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使用無菌水將其孢子濃度調(diào)整為106 CFU/mL，用移液器吸取200 μL上述調(diào)整后的菌絲體（或分生孢子）溶液，均勻涂布于PDA平板;用無菌牙簽蘸取少許內(nèi)生細(xì)菌的甘油菌液，點(diǎn)接于上述PDA平板，每株細(xì)菌點(diǎn)取3次;28?℃恒溫培養(yǎng)3～5?d，觀察點(diǎn)菌處有無明顯的抑菌圈。根據(jù)抑菌圈的有無及大小初篩出具有拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌。（2）平板對(duì)峙復(fù)篩。仿上述操作活化禾谷鐮刀菌或黃曲霉菌。使用0.5 mm打孔器打取菌絲塊，無菌接種針挑取菌絲塊轉(zhuǎn)接并倒貼于新鮮制備的PDA平板（9.0 cm）中央處，同時(shí)用無菌牙簽蘸取初篩出的甘油菌液，四點(diǎn)法點(diǎn)接于距離病原菌絲塊中心3.0 cm處;28?℃培養(yǎng)3～5 d后，測量病原真菌的菌落直徑及內(nèi)生細(xì)菌的菌落大小，進(jìn)一步復(fù)篩出具有較強(qiáng)拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌。以未接內(nèi)生細(xì)菌的病原真菌平板為空白對(duì)照。

1.2.4 ?甘蔗內(nèi)生菌的分子鑒定 ?內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA的提取參考Cheng[31]提出的方法，內(nèi)生真菌的基因組DNA提取方法采用EDTA-SDS方法[29]，內(nèi)生放線菌鑒定所用的DNA模板按如下步驟制備：用一無菌牙簽挑取單菌落，轉(zhuǎn)入含有27 μL TE緩沖液的無菌離心管內(nèi)，充分分散混勻;隨后向離心管內(nèi)加入27 μL KOH（0.4 mol/L）- EDTA（10 mmol/L）裂解液，70?℃水浴5 min;水浴結(jié)束后，向上述混合反應(yīng)液加入3 μL Tris-HCl（pH 4.0）以中和裂解液，12000 r/min室溫離心5 min，此時(shí)的上清液即可作為PCR的DNA模板。

使用gyrB和rpoB基因PCR及測序鑒定內(nèi)生細(xì)菌的種屬地位[32]，真菌和放線菌鑒定所用的分子標(biāo)記則分別是ITS[33]和16S rDNA[34]。除了擴(kuò)增引物有所差異外，三者鑒定所配制的PCR體系完全相同，具體如下（以20 μL為例）：無菌ddH2O

13.7 μL，10×EasyTaq buffer （+Mg2+）2.0 μL， dNTPs 1.6 μL，上下游引物各1.0 μL，EasyTaq DNA聚合酶 0.2 μL，基因組DNA模板0.5 μL。PCR程序參數(shù)如下：94?℃預(yù)變性270 s，30個(gè)循環(huán)體（94?℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72?℃延伸90 s，真菌ITS擴(kuò)增的延伸時(shí)間為45 s），72?℃最終延伸10 min，16?℃保存。PCR結(jié)束后，點(diǎn)樣于0.8%瓊脂糖凝膠上，90 V電泳40～50 min，凝膠成像觀察條帶有無及正確與否。最后送交符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物樣品至昆明碩擎生物公司測序。將測序結(jié)果與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)同源序列比對(duì)，根據(jù)序列的一致性，確定內(nèi)生菌的種屬分類。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?內(nèi)生菌的分離純化及形態(tài)觀察通過組織表面消毒及研磨稀釋的分離與后續(xù)純化操作，從包括野生資源在內(nèi)的17份甘蔗材料中共計(jì)分離到589株細(xì)菌、34株放線菌和46株真菌。從不同組織分離的內(nèi)生菌數(shù)量表現(xiàn)為根>莖>葉。根據(jù)菌落形態(tài)、背面色澤等指標(biāo)，初步將所分離到的589株細(xì)菌劃歸為161類，放線菌劃分成6類。部分內(nèi)生菌的室內(nèi)培養(yǎng)形態(tài)如圖1所示。

2.2 ?具有溶磷、解鉀或固氮活性內(nèi)生細(xì)菌的平板篩選通過在上述相應(yīng)的檢測平板上點(diǎn)菌，發(fā)現(xiàn)部分甘蔗內(nèi)生菌至少有溶磷、固氮或解鉀活性的一種或多種。根據(jù)平板點(diǎn)菌結(jié)果，顯示具有溶磷、

1～6：生長于LB平板的內(nèi)生細(xì)菌; 7～12：生長于PDA平板的內(nèi)生真菌; 13～18：高氏培養(yǎng)基上的內(nèi)生放線菌。固氮或解鉀活性的內(nèi)生細(xì)菌分別有98、41及52株。與伯克霍爾德氏1-2菌株相比，某些甘蔗內(nèi)生細(xì)菌的溶磷圈直徑與之相當(dāng)（圖2 B）。另外還有些細(xì)菌雖無法在NBRIP、Ashby或Aleksandrov平板上形成透明圈，但是菌落直徑較大或隆起，生物累積量較大，顯示其可能也具有一定的溶磷、固氮或解鉀活性（圖2）。

2.3 ?拮抗禾谷鐮刀和黃曲霉菌的內(nèi)生細(xì)菌篩選通過在含有相應(yīng)病原真菌培養(yǎng)基的平板上點(diǎn)菌，初步統(tǒng)計(jì)，能抑制黃曲霉的有44株，能抑制禾谷鐮刀菌的35株（圖3）。

2.4 ?甘蔗內(nèi)生菌的分子鑒定序列擴(kuò)增后均得到單一且明亮的條帶，與預(yù)期大小一致。將所獲得的所有序列片段與NCBI中已知序列進(jìn)行Blast比對(duì)，內(nèi)生細(xì)菌有21個(gè)屬（表

1）。內(nèi)生真菌有17個(gè)屬，分別為枝頂孢屬（Acremonium）、鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、臘孔菌屬（Ceriporia）、枝孢屬（Cladosporium）、粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）、鬼傘屬（Coprinellus）、間座殼屬（Diaporthe）、鐮刀菌屬（Fusarium）、赤霉菌屬（Gibberella）、耙齒菌屬（Irpex）、青霉菌屬（Penicillium）、平革菌屬（Phanerochaete）、射

A：Ashby無氮平板;B：含有25 mg/L溴酚藍(lán)的PVK平板;C：含有25 mg/L溴酚藍(lán)的解鉀平板。

2.5 ?甘蔗內(nèi)生菌在不同品種（系）中分布情況在細(xì)菌的21個(gè)屬中，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬，其次為伯克氏菌屬，緊接著為腸桿菌屬和泛菌屬;栽培種分離到的菌株多于野生種，且分離頻次平均高35.8%（表1）。分離到的17個(gè)內(nèi)生真菌屬中鐮刀菌屬為優(yōu)勢屬，甘蔗栽培種中分離到的菌株也是多余野生種，其中從崖城89-9栽培種中分離到的屬種類最多（表2）。氮的有11株，解磷的有16株，解鉀的有8株;芽孢桿菌屬固氮、溶磷、解鉀的分別有5、32、11株，抑制黃曲霉的有32株，抑制禾谷鐮刀菌的有15株。

3 ?討論

在甘蔗中，只是單方面的從栽培品種或甘蔗植株中的某一個(gè)組織中分離內(nèi)生菌，大部分的研究主要是集中在固氮菌以及促生長的研究上[35]，盡管現(xiàn)在大家對(duì)微生物的興趣日益濃厚，但大多數(shù)研究僅限于土壤和根系樣本或莖部，此外都是比較有目的性的分離內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)于真菌及放線菌的分離報(bào)道也比較少。本研究為了盡可能多分離到多樣性的可培養(yǎng)內(nèi)生菌，采用了非選擇性和選擇性培養(yǎng)基相結(jié)合的方法同時(shí)對(duì)野生種及栽培種內(nèi)生菌進(jìn)行分離、純化。獲得的內(nèi)生細(xì)菌和真菌分屬于21個(gè)屬和17個(gè)屬，顯示了較為豐富的多樣性，而內(nèi)生放線菌僅為單一的鏈霉菌屬。栽培品種（系）所含內(nèi)生菌在數(shù)量和多樣性上均高于野生種無性系，但野生種中也分離到栽培種中沒有的短波單胞菌屬。這些差異將有助于推動(dòng)對(duì)野生種內(nèi)生菌的研究。這與譚志遠(yuǎn)等[36]、王麗等[23]、胡春錦等[26]分離到的內(nèi)生菌存在一定差異，可能是所用的培養(yǎng)基、生長地域、采樣時(shí)間、種質(zhì)資源、宿根年限、采樣部位等不同所造成的。今后還有待于對(duì)原生境中的野生種內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定，與資源圃保種中的進(jìn)行比較研究，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)內(nèi)生菌在不同地域環(huán)境中的聯(lián)系和變化。同時(shí)下一步有必要研究親本和后代之間的內(nèi)生菌的關(guān)聯(lián)，從而從遺傳關(guān)系上尋找內(nèi)生菌與甘蔗互作的規(guī)律。當(dāng)然要比較客觀反映內(nèi)生菌群多樣性，還需借助宏基因組學(xué)等方法對(duì)不可培養(yǎng)的內(nèi)生菌群進(jìn)行分析研究[37-38]。

在生防菌中，芽孢桿菌屬是非常有應(yīng)用前景的[39-41]一大類。特別是枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌對(duì)環(huán)境安全，具有良好的定殖能力且能保護(hù)植物免受病原真菌的侵害[42]，還有促生長的作用[43]。目前伯克霍爾德氏菌屬在內(nèi)生菌中占據(jù)著很重要的位置。Luvizotto 等[44]從巴西甘蔗根部分離到的內(nèi)生細(xì)菌中有39株為伯克氏菌屬細(xì)菌，它們在固氮、溶磷、產(chǎn)吲哚乙酸及產(chǎn)嗜鐵素方面至少占有雙重功能。Lin等[45]研究表明腸桿菌屬細(xì)菌可以固定空氣中游離氮以及促進(jìn)甘蔗生長并提高甘蔗產(chǎn)量。Mehnaz等[46]發(fā)現(xiàn)巴基斯坦的甘蔗中分離出的內(nèi)生腸桿菌屬占據(jù)主導(dǎo)地位。Taulé等[47]也證明烏拉圭的甘蔗植株中，腸桿菌屬也是內(nèi)生菌中一個(gè)重要組成部分。Tam等[48]認(rèn)為腸桿菌屬、無色細(xì)菌屬及泛菌屬內(nèi)生菌，有利于甘蔗在貧瘠的磚紅壤土及強(qiáng)淋溶土中生長。Mendes等[49]從巴西甘蔗根和莖內(nèi)分離到4個(gè)菌屬內(nèi)生菌中以伯克霍爾德菌屬為優(yōu)勢菌群。Roci等[50]在墨西哥甘蔗栽培種中分離到伯克霍爾德菌的多個(gè)種類，并在促進(jìn)植物生長方面具有潛能。本研究的結(jié)果與前人研究結(jié)果相似[51-52]，芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、不動(dòng)桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬及根瘤菌屬在大部分甘蔗品種均能高頻率地分離到。固氮、溶磷、解鉀、拮抗等功能菌株也主要集中在芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、類芽孢桿菌屬及泛菌屬，可見厚壁菌門和變形菌門中的主要類群可能對(duì)植物的生長發(fā)育、增強(qiáng)抗性等發(fā)揮較大的作用，也是甘蔗生產(chǎn)上最有應(yīng)用潛力的類群。本研究分離獲得的功能菌株大多數(shù)生長速度較快，有部分菌株兼具固氮、溶磷、拮抗等功能，其在根際土壤中的存活定居的可能性大，將來有可能開展這些菌株對(duì)甘蔗的實(shí)際促生長效應(yīng)、生態(tài)安全評(píng)估和最佳的生長條件進(jìn)行研究，從而為下一步制成可施用于蔗田的菌劑產(chǎn)品儲(chǔ)備菌種資源。

參考文獻(xiàn)

[1]賈 ?栗， 陳疏影， 翟永功， 等. 近年國內(nèi)外植物內(nèi)生菌產(chǎn)生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 中草藥， 2007， 38（11）： 1750-1754.

[2]江 ?曙， 錢大瑋， 段金廒， 等. 植物內(nèi)生菌與道地藥材的相關(guān)性研究[J]. 中草藥， 2008， 39（8）： 1268-1272.

[3]Bacon C W， Porter J K， Robbins J D， et al. Epichloe typhina from toxic tall fescue grasses[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1977， 34（5）： 576-581.

[4]Stierle A， Strobel G， Stierle D. Taxol and taxane production by Taxo-myces andreanae， an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science， 1993， 260（5105）： 214-216.

[5]方珍娟， 張曉霞， 馬立安. 植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展[J]. 長江大學(xué)學(xué)報(bào)（自科版）， 2018， 15（10）： 41-45.

[6]張婉婷， 張靈枝. 茶樹內(nèi)生真菌的研究進(jìn)展[J]. 中國茶葉加工， 2011（4）： 32-36.

[7]石晶盈， 陳維信， 劉愛媛. 植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2006， 26（7）： 2395-2401.

[8]張祺玲， 楊宇紅， 譚周進(jìn)， 等. 植物內(nèi)生菌的功能研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2010， 7： 28-34.

[9]Chen W M， Tang Y Q， Mort K， et al. Distribution of culturable endophytic bacteria in aquatic plants and their potential for bioremediation in polluted waters[J]. Aquatic Biology， 2012， 15 （2）： 99-110.

[10]郭 ?瑩， 秦玉瑩， 鞠天琛， 等. 一株穗花狐尾藻內(nèi)生菌的分離鑒定及其溶磷特征研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 36（12）： 4352-4360.

[11]陽 ?潔， 秦瑩溪， 王曉甜， 等. 廣西藥用野生稻內(nèi)生細(xì)菌多樣性及促生作用[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2015， 34（11）： 3094-3100.

[12]Strobel G A， Miller R V， Martinez M C， et al. Cryptocandin， a potent antimycotic from the endophytic fungus Cryptosporiopsis cf.quercina[J]. Microbiology， 1999， 145（8）： 1919-1926.

[13]Li J Y， Strobel G， Harper J， et al. Cryptocin，a potent tetramic acid antimycotic from the endophytic fungus Cryptosporiopsis cf. quercina[J]. Organic Letters， 2000， 2（6）： 767-770.

[14]何 ?紅， 蔡學(xué)清. 辣椒內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌的篩選[J]. 中國生物防治， 2002， 18（4）： 171-175.

[15]何 ?紅， 蔡學(xué)清， 關(guān) ?雄， 等. 內(nèi)生菌BS-2菌株的抗菌蛋白及其防病作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2003， 33（4）： 373-378.

[16]袁 ?軍， 孫福在. 防治馬鈴薯環(huán)腐病有益內(nèi)生細(xì)菌的分離和篩選[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2002， 42（3）： 270-274.

[17]Mitchell A M， Strobel G A， Moore E， et al. Volatile antimicrobials from Muscodor crispans， a novel endophytic fungus[J]. Microbiology， 2009， 156（Pt1）： 270-277.

[18]王 ?霞， 薛林貴， 張曉華， 等. 菘藍(lán)內(nèi)生細(xì)菌的分離、篩選和鑒定[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2018， 34（3）： 163-169.

[19]胡春錦， 林 ?麗， 史國英， 等. 廣西甘蔗根際高效聯(lián)合固氮菌的篩選及鑒定[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2012， 32（15）： 4745-4752.

[20]魏春燕. 內(nèi)生固氮菌DX120E與甘蔗互作的生理和分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2016.

[21]張洪彬. 甘蔗及其根際土壤固氮菌的分離和特性研究[D]. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[22]狄義寧， 劉魯峰， 謝林艷， 等. 一株甘蔗內(nèi)生菌鑒定及其溶磷能力的研究[J]. 作物雜志， 2018（6）： 68-75.

[23]王 ?麗， 張劍亮， 王繼華， 等. 甘蔗莖部內(nèi)生細(xì)菌的分離及分子鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（11）： 2227-2232.

[24]邢永秀， 楊麗濤， 黃思良， 等. 甘蔗莖內(nèi)兩個(gè)內(nèi)生菌株16SrRNA序列分析及其生長特性[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2008， 35（11）： 1732-1737.

[25]史國英， 魏源文， 林 ?麗， 等. 1株甘蔗根際促生細(xì)菌的鑒定及其生物學(xué)功能研究初報(bào)[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 29（5）： 1110-1114.

[26]胡春錦， 史國英， 曾 ?泉， 等. 兩種不同土壤條件下可培養(yǎng)甘蔗內(nèi)生固氮菌的多樣性[J]. 中國土壤與肥料， 2017 （2）： 141-148.

[27]沈 ?萍， 范秀容， 李廣武， 等. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版. 北京： 高等教育出版社， 1999： 54.

[28]Gupta R， Singal R， Shankar A， et al. A modified plate assay for screening phosphate solubilizing microorganisms[J]. The Journal of General and Applied Microbiology， 1994， 40（3）： 255-260.

[29]Sen M， Sen S P. Interspecific transformation in Azotobacter[J]. Microbiology， 1965， 41（1）： 1-6.

[30]Prajapati K B， Modi H A. Isolation and characterization of potassium solubilizing bacteria from ceramic industry soil[J]. Centre for Info Bio Technology Journal of MicroBiology， 2012， 1（2-3）： 8-14.

[31]Cheng H R， Jiang N. Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts[J]. Biotechnology Letters， 2006， 28（1）： 55-59.

[32]Yamamoto S， Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1995， 61（3）： 1104-1109.

[33]White T J， Bruns T， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//Innis M A， Gelfand D H， Sninsky J J， et al. PCR protocols： a guide to methods and applications， San Diego： Academic Press 1990： 315-322.

[34]王 ?靖. 十字花科作物根腫病生防放線菌研究[D]. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

[35]Kruasuwan W， Thamchaipenet A. Diversity of culturable plant growth-promoting bacterial endophytes associated with sugarcane roots and their effect of growth by co-inoculation of diazotrophs and actinomycetes[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2016， 35（4）： 1074-1087.

[36]譚志遠(yuǎn)， 傅琴梅， 彭桂香， 等. 青香茅和五節(jié)芒內(nèi)生固氮菌的分離與生理生化鑒定[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2013， 19（4）： 643-649.

[37]范念斯， 齊 ?嶸， 楊 ?敏. 未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)方法進(jìn)展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2016， 22（3）： 524-530.

[38]Magnani G S， Cruz L M，Weber H.， et al. Cuture-independent analysis of endophytic bacterial communities associated with Brazilian sugarcane[J]. Genetics and Molecular Research， 2013， 12 （4）： 4549-4558.

[39]Choudhary D K， Johri B N. Interactions of Bacillus spp. and plants-with special reference to induced systemic resistance （ISR）[J]. Microbiological Research， 2009， 164（5）： 493-513.

[40]Hobley L， Ostrowski A， Rao F V， et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2013， 110（33）： 13600-13605.

[41]Ongena M， Jacques P. Bacillus lipopeptides： versatile weapons for plant disease biocontrol[J]. Trends in Microbiology， 2008， 16（3）： 115-125.

[42]Zhao P， Quan C， Wang Y， et al. Bacillus amyloliquefaciens Q‐426 as a potential biocontrol agent against Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae[J]. Journal of Basic Microbiology， 2014， 54（5）： 448-456.

[43]Turner J T， Backman P A. Factors relating to peanut yield increases after seed treatment with Bacillus subtilis[J]. Plant Disease， 1991， 75（4）： 347-353.

[44]Luvizotto D M， Marcon J， Andreote F D， et al. Genetic diversity and plant-growth related features of Burkholderia spp. from sugarcane roots[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2010， 26（10）： 1829-1836.

[45]Lin L， Li Z， Hu C， et al. Plant growth-promoting nitrogen-fixing enterobacteria are in association with sugarcane plants growing in Guangxi， China[J]. Microbes and Environments， 2012， 27（4）： 391-398.

[46]Mehnaz S， Baig D N， Lazarovits G. Genetic and phenotypic diversity of plant growth promoting rhizobacteria isolated from sugarcane plants growing in Pakistan[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology， 2010， 20（12）： 1614-1623.

[47]Taulé C， Mareque C， Barlocco C， et al. The contribution of nitrogen fixation to sugarcane （Saccharum officinarum L.）， and the identification and characterization of part of the associated diazotrophic bacterial community[J]. Plant and Soil， 2012， 356（1-2）： 35-49.

[48]Tam H M， Diep C N. Isolation， characterization and identification of endophytic bacteria in sugarcane （Saccharum spp. L.） cultivated on soils of the Dong Nai province， Southeast of Vietnam[J]. American Journal of Life Sciences， 2014， 2（6）： 361-368.

[49]Mendes R， Pizzirani-Kleiner A A. Araujo W L， et al. Diversity of Cultivated Endophytic Bacteria from Sugarcane： Genetic and Biochemical Characterization of Burkholderia cepacia Complex Isolates[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73（22）： 7259-7267.

[50]Rocio C G， Lourdes M A， Augusto R T， et al. High diversity of culturable Burkholderia species associated with sugarcane[J]. Plant & Soil， 2011， 345 （1-2） ： 155-169.

[51]Magnani G S， Didonet C M， Cruz L M， et al. Diversity of endophytic bacteria in Brazilian sugarcane[J]. Genetics and Molecular Research， 2010， 9（1）： 250-258.

[52]Pereira P， Ibá?ez F， Rosenblueth M， et al. Analysis of the bacterial diversity associated with the roots of maize （Zea mays L.） through culture-dependent and culture-independent methods[J]. ISRN Ecology， 2011： 1-9.