葉曉明，錢宇汀，葉 雯，沈黃瑩，曾燕如，喻衛(wèi)武，戴文圣

（浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州311300）

香榧Torreya grandis‘Merrillii’是紅豆杉科Taxaceae榧樹Torreya grandis的優(yōu)良變異類型，經人工選育后嫁接繁殖栽培的優(yōu)良品種，也是目前榧樹中唯一進行人工規(guī)模栽培的品種［1-2］。它集果用、油用、藥用、材用和綠化觀賞為一體，經濟價值非常高［3］，老產區(qū)在浙江會稽山區(qū)的諸暨、柯橋、嵊州、東陽和磐安等5縣（市、區(qū)），分布范圍狹窄，產量極其有限，產品供不應求。全國10余個省（市、自治區(qū)）均在引種栽植［4］。近年來，隨著香榧產業(yè)的發(fā)展，香榧綠藻病害日趨嚴重，給榧農造成重大經濟損失，尤其是人工林中，其對香榧葉片的光合作用產生極大影響并造成落花落果，甚至導致香榧樹死亡，逐漸引起了榧農的重視。吾中良等［4］首次報道了香榧綠藻病害。香榧綠藻Chlorellasp.為小球藻屬Chlorella的變異類型，是附著在榧樹枝和葉上形成表面粗糙的灰綠色苔狀物［5］，因病原歸屬于綠藻門Chlorophyta，且在香榧枝葉上分布較多，生產上一般稱之為香榧綠藻，但也有研究者認為其是青苔（moss）和地衣（lichens）［6］。專家學者對其防治方法進行了研究［5，7］，但研究仍處于起步階段，其危害機理尚不明確，病原種類也尚無定論。本研究結合傳統(tǒng)形態(tài)學方法和分子生物學技術，通過對香榧綠藻的培養(yǎng)觀察及18S rDNA和內轉錄間隔區(qū)（ITS）基因序列分析，探索了香榧綠藻的生活習性，初步鑒定了香榧綠藻的種屬類別，為香榧綠藻的綜合防治和香榧產業(yè)的健康發(fā)展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 香榧綠藻 2017年7月中旬，在浙江省杭州市臨安區(qū)、安徽省黃山市和浙江省諸暨市3個地區(qū)分別采集患有香榧綠藻病的香榧葉片，密封帶回實驗室，用滅菌后的小刀片從患病葉片上刮取香榧綠藻混合物用于離體培養(yǎng)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 綠藻的培養(yǎng)采用SE液/固體培養(yǎng)基［8］，其中液體培養(yǎng)基配方主要成分如下：硝酸鈉250 mg·L-1， 三水磷酸氫二鉀 75 mg·L-1， 七水硫酸鎂 75 mg·L-1，二水氯化鈣 25 mg·L-1，磷酸二氫鉀175 mg·L-1， 氯化鈉 25 mg·L-1， 六水合三氯化鐵 5 mg·L-1， A5 處理液 1.000 g·L-1（主要包括硼酸 2.860 g·L-1，四水氯化錳 1.810 g·L-1， 七水硫酸鋅 0.220 g·L-1， 五水硫酸銅 0.079 g·L-1， 四水合鉬氨酸 0.390 g·L-1）和Fe-EDTA 處理液 1.000 g·L-1（包括乙二胺四乙酸鈉 10.000 g·L-1和六水合三氯化鐵 0.810 g·L-1）［9］。 配制好的液體培養(yǎng)基自然pH值為（6.70±0.05），在1 L液體培養(yǎng)基中加入1.500 g瓊脂糖，經高溫滅菌（121℃，30 min）冷凝后形成SE固體培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠藻的混合培養(yǎng) 取少量香榧綠藻混合物，置于盛有100 mL SE液體培養(yǎng)基的三角瓶中靜置培養(yǎng)， 溫度（23±2） ℃， 光照強度為 6 000 lx（120 μmol·m-2·s-1）， 24 h 持續(xù)光照， 培養(yǎng) 2 周［10］。

1.2.2 綠藻的分離純化培養(yǎng) 采用平板劃線分離法將混合培養(yǎng)后的香榧綠藻接種在SE固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)1周后，根據(jù)藻體的形態(tài)特征將不同形態(tài)的綠藻用接種針取出，分別培養(yǎng)于SE液體培養(yǎng)基中，并進行放大培養(yǎng)進一步純化，直至各組培養(yǎng)液中只有一種形態(tài)的綠藻，獲得A和B組2組香榧綠藻，定期觀察藻液，并用熒光顯微鏡拍照記錄。

1.2.3 香榧綠藻生長曲線的繪制 從A和B組香榧綠藻培養(yǎng)液中取1～2滴處于對數(shù)增長期的藻液，分別置于盛有100 mL滅菌SE液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為（23±2）℃，光照強度為6 000 lx（120 μmol·m-2·s-1），24 h持續(xù)光照的培養(yǎng)室中，靜置培養(yǎng)1個月，做3個重復。每天早晚將培養(yǎng)瓶震動1次，防止藻細胞貼壁生長，且每隔2 d在紫外分光光度計680 nm［11］下測定光密度。

1.2.4 pH值對香榧綠藻生長的影響 從A和B組香榧綠藻培養(yǎng)液中分別取1～2滴對數(shù)增長期的藻液，加入 pH 值為 6.0，7.0， 8.0，9.0， 10.0， 11.0（用 0.1 mol·L-1鹽酸和 0.1 mol·L-1氫氧化鈉調節(jié)）的 SE 液體培養(yǎng)基中，原培養(yǎng)基（自然pH值）為對照組，培養(yǎng)3周，做3個重復，且每隔2 d在紫外分光光度計680 nm 下測定吸光度［10］。

1.2.5 18S rDNA序列獲取 ①香榧綠藻DNA的提取。取100 mL對數(shù)生長期的藻液，分裝至50 mL離心管中，6 000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集的藻體研磨后用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit（編碼9768）試劑盒提取基因組DNA。②引物合成。用于真核綠藻18S rRNA基因的上游引物 MA1（5′-CGGGATCCGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和下游引物 MA2（5′-CGGAATTCCTTCTGCAGGTTCACC-3′），由上海生工生物技術有限公司進行合成。③PCR擴增。以香榧綠藻樣品的基因組DNA為模板，對香榧綠藻18S rDNA進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL，包括：雙蒸水21 μL，上下引物各 1 μL， DNA 模板 1 μL， 2×Gflex PCR 緩沖液（鎂離子，dNTP plus）25 μL， Tks Gflex DNA Polymerase（1.25×16.67 nkat·L-1）1 μL。 PCR 反應條件： 94 ℃預變性 1 min； 98 ℃變性 10 s， 55 ℃退火 15 s，68℃延伸60 s，30個循環(huán)。PCR產物取5 μL經10 g·L-1（1×TAE）瓊脂糖凝膠電泳檢測后，觀察并成像［12］。擴增產物由大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）進行測序。

1.2.6 ITS序列獲取 以香榧綠藻樣品的基因組DNA為模板，分別以正反向引物對香榧綠藻ITS區(qū)進行PCR擴增，并對PCR產物進行測序。香榧綠藻ITS正反向引物序列［13-14］：1800f：ACCTGCGGAAGGATCATT，LR 1850：CCTCACGGTACTTGTTC由大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）進行合成。PCR反應體系和反應條件與18S rDNA序列獲取條件一致。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 測序結果與美國國立生物技術信息中心（NCBI）已知的數(shù)據(jù)庫進行比較，并用Genetyx軟件進行多重序列對齊排列，通過MEGA 7.0軟件鄰接（NJ）法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，基于Kimura2-Prameter方法計算遺傳距離值，計算Bootstrap值，重復1 000次［15］。

2 結果與討論

2.1 香榧綠藻正置熒光顯微鏡觀察結果

對3個不同地點采樣的香榧綠藻培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)：香榧綠藻主要由2種形態(tài)的綠藻構成，按形狀、大小等細胞特性將分離純化的香榧綠藻分為A組和B組，其形態(tài)結構見圖1。臨安和黃山地區(qū)采集的香榧綠藻均由A組和B組不同形態(tài)的綠藻組成，而諸暨地區(qū)采集的香榧綠藻只含A組形態(tài)的綠藻。表明不同地區(qū)香榧綠藻的形態(tài)不盡相同，但主要以A組形態(tài)綠藻為主，這可能與當?shù)赝寥乐械脑孱惙植加嘘P，因為綠藻主要通過空氣中揚塵進行傳播［16］，同時地理位置的差異也會導致藻類形態(tài)的多樣性［10］。從生活習性上來看，香榧綠藻屬于氣生藻Luftalgen aerophtische類植物的樹生藻，與小球藻Chlorellasp.不同的是其主要在樹干以及枝葉表面生長，它們所需要的水分可以從降雨和蒸汽中得到［17］。

藻類的鑒定方法包括傳統(tǒng)形態(tài)學方法、生物化學法和分子生物學法。傳統(tǒng)形態(tài)學方法是通過對藻類的培養(yǎng)觀察，根據(jù)藻體的形狀、大小等形態(tài)學特征鑒定藻的種類。本研究通過熒光顯微鏡觀察結果顯示：A組香榧綠藻為單細胞圓形，直徑10.36～22.79 μm，葉綠體布滿整個細胞，細胞壁薄且光滑；非油性，淡綠色單胞，無鞭毛。B組香榧綠藻為單細胞橢圓形或長橢圓形，兩端鈍圓，長21.07～25.21 μm，寬10.36～12.43 μm，葉綠體多位于細胞的一側；油性，淡綠色，細胞間以單鏈相連，無分支，基部有一著生細胞，與李潤霞等［18］鑒定的黃瓜綠藻病病原絲藻Ulothrixsp.的形態(tài)特征基本一致。2組香榧綠藻的形態(tài)結構與前人從沙漠和海洋分離純化的藻種形態(tài)不一致［19-21］，應該是樹生藻為適應寄生環(huán)境形成的特殊形態(tài)結構。

圖1 2組香榧綠藻的熒光顯微鏡觀察照片F(xiàn)igure 1 Fluorescence microscopy observation of two groups of Chlorella sp.

2.2 2組香榧綠藻的生長曲線

香榧綠藻生長特性與大部分藻類相似，在培養(yǎng)初期（適應期）藻體生長緩慢，進入對數(shù)生長期后，生長速率迅速增加，藻液也由淺綠色變?yōu)榘稻G色，直到飽和停止增長，進入衰亡期后，藻體逐漸死亡并下沉，藻液顏色開始變黃，最后至無色、腐爛［10］。由圖2可知：A組香榧綠藻的適應期較長，前4 d是適應期，第5天進入對數(shù)生長期，第31天進入穩(wěn)定期；B組香榧綠藻的適應期短，第2天即進入對數(shù)生長期，第29天進入穩(wěn)定期；2組香榧綠藻的混合樣H適應期也較短，第3天進入對數(shù)生長期，第27天進入穩(wěn)定期。

H組為A和B組香榧綠藻的混合樣。比較發(fā)現(xiàn)：香榧綠藻培養(yǎng)前期生長速率從大到小依次為B組、A組、H組，第9～13天差異顯著（P＜0.05）；香榧綠藻培養(yǎng)19 d后生長速率從大到小依次為A組、B組、H組，培養(yǎng)23 d時達顯著水平（P＜0.05），表明2組香榧綠藻生長期不一致，B組香榧綠藻在生長前期占有優(yōu)勢，而A組香榧綠藻在生長后期占優(yōu)勢，且2組香榧綠藻存在競爭關系，導致2組香榧綠藻混合后生長速率最慢（圖2）。通過生長曲線結果可知：2組香榧綠藻均表現(xiàn)出較長的生長周期，1個月內均沒有進入衰亡期，因此香榧綠藻在香榧葉上能長期生存下來。

圖2 香榧綠藻的生長曲線Figure 2 Growth curve of Chlorella sp.

2.3 pH值對香榧綠藻生長的影響

由圖3可知：A組香榧綠藻在pH 10.0和pH 11.0的培養(yǎng)基上生長最好，在度過適應期（前5 d）后出現(xiàn)爆發(fā)式增長，長勢明顯優(yōu)于其他各組，pH 9.0培養(yǎng)基中的A組香榧綠藻在第11天增長速度加快，長勢逐漸接近pH 10.0和pH 11.0的香榧綠藻，且pH 6.0的培養(yǎng)基會明顯抑制A組香榧綠藻的生長。香榧綠藻的生長速率從大到小依次為pH 11.0、pH 10.0、pH 9.0、pH 8.0、pH 7.0、對照組、pH 6.0。得出A組香榧綠藻最適生長的pH值為11.0，說明A組香榧綠藻適合在堿性環(huán)境中生長，酸性環(huán)境會抑制A組香榧綠藻的生長。

由圖3可知：B組香榧綠藻同樣在pH 10.0和pH 11.0的培養(yǎng)基上生長最好，在度過適應期（前3 d）后出現(xiàn)爆發(fā)式增長，長勢明顯優(yōu)于其他各組，分別在第15天和第13天進入穩(wěn)定期；pH 8.0和pH 9.0培養(yǎng)基中的B組香榧綠藻在第9天增長速度加快，長勢逐漸接近pH 10.0和pH 11.0，并分別在第23天和第19天進入穩(wěn)定期；且pH 6.0的培養(yǎng)基會明顯抑制B組香榧綠藻的生長。香榧綠藻生長速率從大到小依次為pH 11.0、pH 10.0、pH 9.0、pH 8.0、pH 7.0、對照組、pH 6.0。得出B組香榧綠藻最適生長的pH值為11.0，說明B組香榧綠藻也適合在堿性環(huán)境中生長，酸性環(huán)境同樣會抑制B組香榧綠藻的生長。相比于A組香榧綠藻，B組香榧綠藻更早進入穩(wěn)定期，且光密度值明顯低于A組香榧綠藻。這可能與細胞的排列結構有關，鏈狀結構限制了B組香榧綠藻的增長。

培養(yǎng)基中pH值是藻類生長代謝等許多生理過程的重要影響因子，pH值會影響培養(yǎng)基中藻細胞對元素的吸收和利用以及對代謝產物的利用，從而影響藻類的光合作用和呼吸作用［22-23］。每一種藻類都有它自身適合的pH值范圍，改變pH值會影響藻類的生長和光合作用［24-25］。趙娜等［26］研究表明：小球藻的最適生長pH值為7.0，而斜生柵藻Scenedesmus obliquus的最適生長pH值為9.0。本研究顯示：香榧綠藻在pH 11.0環(huán)境下生長最好，說明其具有較好的耐堿能力，這與斜生柵藻對pH值的反應規(guī)律相似［26］，表明香榧綠藻的生活習性與斜生柵藻更為接近。在堿性環(huán)境中，細胞可維持較好的分裂速度，這也與袁麗娜等［27］的研究結果一致：低pH值不利于藻生長，在一定范圍內較高的pH值能促進藻細胞增殖。因此，香榧綠藻適合生長在堿性環(huán)境中，酸性環(huán)境可有效抑制香榧綠藻的生長，這也為香榧綠藻的防治提供了新思路。

圖3 pH值對A和B組香榧綠藻生長的影響Figure 3 Effects of pH on the growth of group A and B

2.4 2組香榧綠藻18S rDNA序列分析

對具有代表性的2組香榧綠藻CTG1003-XQ（A組）和CTG1003-SZ（B組）進行18S rDNA序列分析，擴增出長度均為1 678 bp的基因片段（圖4）。

NCBI中BLAST結果表明：香榧綠藻A組和B組的18S rDNA堿基序列完全相同，且與GenBank上屬于柵藻科Scenedesmace的Asterarcys quadricellulareKNUA020（JQ043183.1）和Asterarcys quadricellulareComas 77/75（AF388375.1）的同源性高，相似率均達100%。由圖5可以看出：A組和B組香榧綠藻跟柵藻科聚簇成一支，跟Asterarcys quadricellulareKNUA020和Asterarcys quadricellulareComas77/75的節(jié)點支持率為53，遺傳距離為0.00，說明這2組香榧綠藻很有可能屬于Asterarcys quadricellulare。

傳統(tǒng)形態(tài)學方法存在一定局限性，藻類形態(tài)差異小、鑒定周期長、形態(tài)不穩(wěn)定［28］等因素導致其物種鑒定面臨著不少難題。對此分子鑒定技術應運而生，它是根據(jù)物種的基因差異來定性分類物種，可以快速穩(wěn)定鑒定藻類［29］。近年來，國內外學者通過對18S rRNA基因片段的差異分析鑒定了多種藻類［19，30-31］，但由于其片段保守性，僅適用于分析高階元如屬間或目間的物種［32-33］。本研究通過對香榧綠藻18S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)：香榧綠藻基因序列與柵藻科的Asterarcys quadricellulare親緣關系較近，印證了本研究中香榧綠藻對pH值的反應規(guī)律與斜生柵藻Scenedesmus obliquus的結果相同，表明香榧綠藻屬于柵藻科。這與本研究形態(tài)學分類的結果不一致，與早期研究者對香榧綠藻的認知不同。

圖4 2組代表性香榧綠藻的18S rDNA PCR電泳圖Figure 4 Electrophoresis of PCR products 18S rDNA of two representative Chlorella sp.

2.5 2組香榧綠藻ITS序列分析

對具有代表性的2組香榧綠藻CTG1003-XQ（A組）和CTG1003-SZ（B組）的ITS區(qū)基因片段進行序列分析，擴增出總長度均為874 bp的基因片段（圖6），且2組香榧綠藻的堿基序列完全一致。根據(jù)FAGGIAN等［34］的劃分方法，香榧綠藻ITS1區(qū)長297 bp，5.8S rDNA長287 bp，ITS2區(qū)長290 bp。

NCBI中BLAST結果表明：香榧綠藻A組和B組的ITS區(qū)基因序列與GenBank上Asterarcys quadricellulare和Scenedesmussp.SM15_4（KT778094.1）的同源性高，相似率均達100%。由圖7可以看出：A組和B組香榧綠藻跟柵藻科聚簇成一支，跟Asterarcys quadricellulare和Scenedesmussp.的節(jié)點支持率為99，遺傳距離為0.00，表明2組香榧綠藻均與柵藻科的Asterarcys quadricellulare以及Scenedesmussp.的ITS區(qū)基因序列一致。本結果進一步證實了香榧綠藻與柵藻科的親緣關系，與本研究中香榧綠藻18S rDNA序列比對的結果基本一致。

圖5 2組代表性香榧綠藻的18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree based on 18S rDNA sequencing of two representative Chlorella sp.

香榧綠藻18S rDNA序列和ITS區(qū)基因序列均與Asterarcys quadricellulare相似率達100%，表明香榧綠藻與Asterarcys quadricellulare屬于同一物種，與絲藻和小球藻親緣關系較遠。香榧綠藻ITS區(qū)基因序列與柵藻科的物種Scenedesmussp.的ITS區(qū)基因序列相似率也達100%，但兩者的18S rDNA序列相差較大，表明柵藻ITS區(qū)基因序列種間保守性較強，不利于種間的區(qū)分。這與前人對其他物種的研究結果相反［35-36］。一般認為，ITS區(qū)基因序列變異性更大，說明不同物種間基因片段的保守性不盡相同。

結合形態(tài)分析發(fā)現(xiàn)：A組香榧綠藻的形態(tài)特征也與Asterarcys quadricellulare相近［30］，說明 A組香榧綠藻屬于Asterarcys quadricellulare，B組香榧綠藻形態(tài)與Asterarcys quadricellulare形態(tài)差異較大，可能為其變種。HONG 等［30］發(fā)現(xiàn)：Asterarcys quadricellulare來自于韓國慶北國立大學（Kyungpook National University）花園土壤中的一種微型藻類，含有大量的長鏈多不飽和脂肪酸和脂肪醇，說明香榧綠藻也有產生長鏈多不飽和脂肪酸和脂肪醇的潛力，具有一定的科研價值。而GenBank上Scenedesmussp.的ITS區(qū)基因序列樣品來源于中國浙江［37］，與香榧綠藻親緣關系較近，對香榧綠藻的鑒定具有重要意義。

圖6 2組代表性香榧綠藻的ITS PCR電泳圖Figure 6 Electrophoresis of PCR products ITS of two representative Chlorella sp.

3 結論

本研究表明：香榧綠藻由A組和B組2種不同形態(tài)的藻類組成，并主要以A組形態(tài)綠藻為主，2種形態(tài)的香榧綠藻間存在競爭關系。根據(jù)形態(tài)學鑒定表明：A組香榧綠藻與引起番茄綠藻病的橢圓小球藻形態(tài)相近，B組香榧綠藻與引起黃瓜綠藻病的絲藻形態(tài)相近；但香榧綠藻對pH值的反應規(guī)律與斜生柵藻相近。序列比對也發(fā)現(xiàn)：2種形態(tài)的香榧綠藻的18S rDNA和ITS區(qū)基因序列均與柵藻科的Asterarcys quadricellulare的同源性高，相似率達100%。因此，本研究將A組香榧綠藻初步鑒定為柵藻科的Asterarcys quadricellulare，B組香榧綠藻為其變種。且2組香榧綠藻的ITS區(qū)基因序列與GenBank上的柵藻科物種Scenedesmussp.相同。pH值會顯著影響香榧綠藻的生長，酸性環(huán)境可有效抑制香榧綠藻的生長，這也為香榧綠藻的防治工作提供了新思路。

圖7 2組代表性香榧綠藻的ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 7 Phylogenetic tree based on ITS sequencing of two representative Chlorella sp.