浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波中醫(yī)院 寧波 315012

免疫性不育在男性不育患者中占較大比例，目前研究認為，血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）的損傷或異常開放導(dǎo)致使精子細胞暴露于自身免疫系統(tǒng)，是造成男性免疫性不育的重要因素之一。支持細胞緊密連接（tight junctions，TJs）是 BTB 的基礎(chǔ)，而閉合蛋白（Occludin）是最早被鑒定明確的TJs結(jié)構(gòu)膜蛋白，在BTB完整性的維持和開閉的調(diào)節(jié)中起到重要作用[1]。本課題組前期研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1) 能影響 BTB 開閉，其機制與影響Occludin表達有關(guān)[2]。p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號途徑廣泛參與了細胞的生理和病理過程，在應(yīng)激反應(yīng)、細胞增殖、分化和凋亡過程中起著重要作用。研究證實，TGF-β1介導(dǎo)的p38MAPK信號途徑參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[3-4]，但TGF-β1是否通過p38MAPK信號途徑調(diào)節(jié)BTB尚未完全明確。

我院男科崔云教授采用自擬方脫敏煎治療男性免疫性不育療效明顯，但脫敏煎是否影響上述病理過程尚不明確，因此本研究以原代培養(yǎng)的睪丸支持細胞為對象，試圖探討TGF-β1在男性免疫性不育發(fā)病機制中的作用以及脫敏煎可能的藥理機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量150～170g，購于上海斯萊克動物有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心 [實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。飼養(yǎng)環(huán)境室內(nèi)溫度（24±2）℃，相對濕度40%～60%，動物自由進食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后用于實驗。

1.2主要試劑和藥品 DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均為美國Hyclone公司產(chǎn)品（批號：0781003、SH30848.01B、SV30087.03）；Ⅱ型膠原酶為上海李記生物科技有限公司產(chǎn)品（批號：C5100L0041）；Real-time PCR Master Mix購于TaKaRa公司（批號：BK1101）；羊抗兔IgG抗體為北京百奧萊博科技有限公司產(chǎn)品（批號：BL0817）；人重組 TGF-β1購于美國Abcam公司（批號：GR1900395）；Occludin兔多克隆抗體購于 Santa Cruz公司（批號：sc40403）；p38MAPK兔多克隆抗體購于南京建成生物工程研究所（批號：Ab41205）；p38MAPK抑制劑SB203580購于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司（批號：421032）。脫敏煎組方藥物女貞子、百合、丹參、丹皮、炒黃芩、徐長卿、防風(fēng)均由本院中藥房提供。

1.3主要試劑和儀器 Mx3000P型熒光定量PCR儀為美國Stratagene公司產(chǎn)品，普通PCR儀為德國Roche公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.4方法

1.4.1睪丸支持細胞原代培養(yǎng) 睪丸支持細胞的純化采用差速貼壁法進行，參考文獻[5]的方法，采用免疫組化方法檢測特異fas配體（fas ligand，F(xiàn)asL）表達對睪丸支持細胞進行鑒定。睪丸支持細胞純度（%）=（FasL陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%，細胞純度達到90%后用于后續(xù)試驗。

1.4.2脫敏煎含藥血清制備 將脫敏煎組方藥物（女貞子 20g、百合 10g、丹參 20g、丹皮 15g、炒黃芩 10g、徐長卿15g、防風(fēng)10g）加水500mL，浸泡2h后煮沸，文火煎30min，重復(fù)2次后，再將藥液繼續(xù)濃縮至100mL，制備成含生藥量1g·mL-1的煎劑備用。將10只SD大鼠隨機分為脫敏煎組和陰性對照組，每組5只。根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[6]中人和實驗動物等效劑量比值表計算出大鼠藥物等效劑量，再乘以培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度。即大鼠灌胃量=臨床常用劑量×動物等效面積系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度。脫敏煎組大鼠予脫敏煎劑灌胃，陰性對照組予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，兩組均灌胃2次/d，連續(xù)10d。采血前禁食不禁水12h以上，末次給藥后2h心臟取血，靜置30min后2 000r/min離心10min分離血清。濾過除菌，-70℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3實驗分組及處理 將原代培養(yǎng)的睪丸支持細胞分為6組，空白對照組、陰性對照組、p38MAPK抑制劑組、TGF-β1刺激組、TGF-β1+p38MAPK 抑制劑組和TGF-β1+脫敏煎組，每組設(shè)5個復(fù)孔。收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為2×106/mL，將細胞接種于6孔板，每孔體積2mL；同時將密度為2.5×106/mL的細胞懸液接種于24孔板，每孔體積0.8mL，當(dāng)細胞融合約50%后，空白對照組加入終濃度為10%的無菌0.9%氯化鈉溶液，陰性對照組加入終濃度為10%的陰性對照組大鼠血清。其余各組細胞依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果均加入終濃度為5ng·mL-1的重組TGF-β1，TGF-β1+p38MAPK 抑制劑組和 TGF-β1+脫敏煎組在此基礎(chǔ)上再分別加入終濃度為 3μmol·L-1SB203580和10%的脫敏煎組大鼠含藥血清，各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)12h后備用。

1.4.4雙室培養(yǎng)模型的建立及睪丸支持細胞跨膜上皮電阻（trans-epithelial electrical resistance，TER）測定 細胞培養(yǎng)及分組同1.4.3。在24孔板中插入Milicell-PCF型培養(yǎng)內(nèi)室，相差顯微鏡下觀察單細胞層形成情況，待細胞融合約90%后，應(yīng)用Milicell-ERS型電阻儀檢測雙室模型內(nèi)、外室的TER。TER計算公式：TER=（測定值-空白本底值)∕膜的有效生長面積。

1.4.5Real-time PCR檢測睪丸支持細胞Occludin和p38MAPK mRNA表達 細胞培養(yǎng)及分組同1.4.3。收集各組細胞，提取總RNA，總RNA提取與cDNA合成按試劑盒說明書操作，cDNA產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。以β-actin作為內(nèi)參照進行擴增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，共40個循環(huán)。以2-△△CT公式計算目的基因相對表達量，比較各組Occludin和p38MAPK mRNA表達的差異。所有引物均由上海生工公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.6Western blot檢測睪丸支持細胞Occludin和p38MAPK蛋白表達 細胞培養(yǎng)及分組同1.4.3。收集各組細胞，裂解后提取總蛋白，蛋白定量后進行SDSPAGE電泳，將電泳后分離的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉后，分別加入Occludin、p38MAPK兔多克隆抗體，4℃過夜，TBST洗滌3次。再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫下反應(yīng)1.5h，0.1%的TBST洗膜后ECL顯色，以β-actin作為內(nèi)參照，采用Image J 1.48分析軟件分析蛋白相對表達量。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組細胞TER比較 與空白對照組比較，陰性對照組細胞的TER差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與兩個對照組比較，p38MAPK抑制劑組細胞TER差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），TGF-β1刺激組、TGF-β1+p38MAPK 抑制劑組和TGF-β1+脫敏煎組細胞TER均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)；與TGF-β1刺激組比較，TGF-β1+p38MAPK抑制劑組與TGF-β1+脫敏煎組細胞TER明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

2.2各組細胞Occludin和p38MAPK mRNA表達比較 與空白對照組比較，陰性對照組細胞Occludin和p38MAPK的mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與兩個對照組比較，p38MAPK抑制劑組細胞Occludin和p38MAPK的mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而 TGF-β1刺激組、TGF-β1+p38MAPK抑制劑組和TGF-β1+脫敏煎組細胞Occludin mRNA相對表達量均明顯降低，p38MAPK mRNA相對表達量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而與 TGF-β1刺激組比較，TGF-β1+p38MAPK抑制劑組與TGF-β1+脫敏煎組細胞的Occludin mRNA相對表達量明顯升高，p38MAPK mRNA相對表達量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表 3。

表2 各組細胞TER比較Tab.2 Comparison of TER in each group

2.3各組細胞Occludin和p38MAPK蛋白表達比較與空白對照組比較，陰性對照組細胞Occludin和p38MAPK蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與兩個對照組比較，p38MAPK抑制劑組細胞Occludin和p38MAPK蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而TGF-β1刺激組、TGF-β1+p38MAPK抑制劑組和TGF-β1+脫敏煎組細胞Occludin蛋白相對表達量降低，p38MAPK蛋白相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；而與TGF-β1刺激組比較，TGF-β1+p38MAPK抑制劑組與TGF-β1+脫敏煎組細胞Occludin蛋白相對表達量升高，p38MAPK蛋白相對表達量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表 4、圖 1。

表3 各組細胞Occludin和p38MAPK mRNA相對表達量比較Tab.3 Comparison of mRNA relative expression quantity of Occludin and p38MAPK in each group

表4 各組細胞Occludin和p38MAPK蛋白相對表達量比較Tab.4 Comparison of protein relative expression quantity of Occludin and p38MAPK in each group

3 討論

BTB是阻止精子與免疫系統(tǒng)接觸的物理屏障，主要由支持細胞TJs組成。TJs包含多種蛋白成份，其中Occludin蛋白是最早被鑒定出的TJs結(jié)構(gòu)膜蛋白，作為構(gòu)成細胞間緊密連接復(fù)合體的骨架蛋白之一，對于細胞間屏障的維持至關(guān)重要。Occludin表達的下降，導(dǎo)致細胞粘附功能的缺失，最終可引起B(yǎng)TB的破壞[7]。支持細胞雙室培養(yǎng)模型常用于支持細胞間TJs功能評價，雙室模型中支持細胞在通透膜上呈單層柱狀生長，胞質(zhì)部分在頂端，胞核在靠近通透膜的底部。在近膜部分，相鄰支持細胞間形成TJs，類似體內(nèi)BTB的結(jié)構(gòu)，其跨膜上皮電阻值可反映支持細胞間連接的緊密程度。研究表明，促進Occludin表達能升高上皮細胞間TER，使TJs變得更緊密；而封閉Occludin表達可降低TER，使細胞間連接變得松散，影響B(tài)TB的功能，最終導(dǎo)致生殖細胞的丟失[8]。

圖1 Western blot檢測各組細胞Occludin和p38MAPK蛋白表達Fig.1 Expression of Occludin and p38MAPK protein in each group measured by Western blot

Occludin蛋白的表達受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中磷酸化信號通路對Occludin蛋白功能的調(diào)節(jié)十分重要。p38MAPK是絲蛋白/蘇氨酸激酶，能接受受體傳遞的信號并傳遞給細胞核內(nèi)的重要分子，在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)以及細胞增殖、分化和凋亡等過程中起著重要作用，被認為是細胞眾多信號傳導(dǎo)通路的中轉(zhuǎn)站。研究證實，p38MAPK信號途徑可影響睪丸支持細胞和腸上皮細胞的Occludin表達[9-10]。

TGF-β1是間質(zhì)細胞的一種局部調(diào)節(jié)因子，廣泛參與體內(nèi)各種病理生理過程，與炎癥、創(chuàng)傷、器官纖維化等多種病理過程的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。TGF-β1在雄性生殖系統(tǒng)中主要表達于睪丸間質(zhì)細胞和附睪主細胞，可通過自分泌和旁分泌等方式調(diào)節(jié)生精細胞、間質(zhì)細胞及睪丸支持細胞的功能[11-12]。陳艷秋等[13]研究發(fā)現(xiàn)，睪丸中TGF-β1表達增強與精子發(fā)生障礙關(guān)系密切。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能調(diào)節(jié)BTB開閉，過量的TGF-β1使Occludin表達下調(diào)，但具體機制尚不清楚。本研究顯示，在體外培養(yǎng)的睪丸支持細胞中，TGF-β1能使p38MAPK表達升高，Occludin表達降低，同時TER也降低；而與TGF-β1刺激組比較，p38MAPK抑制劑能有效降低p38MAPK表達，同時能使Occludin表達升高并恢復(fù)TER。說明TGF-β1可通過p38MAPK信號途徑而影響Occludin表達。

傳統(tǒng)中醫(yī)將免疫性不育歸屬于“不育”“無子”范疇，我院男性科崔云教授通過多年潛心研究，認為本病病位多在肝腎，病因之本為體虛，病因之標(biāo)在損傷和感染；病機為正虛、邪戀不舍。病機中正虛多為肝腎虧虛，其中腎陰虧虛臨床多見；邪戀多為氣滯血瘀濕熱。崔師認為本癥多與瘀、濕有關(guān)，“濕熱痰瘀”為本病的病機核心[14]?；谝陨险J識，崔師自擬經(jīng)驗方“脫敏煎”，藥用女貞子20g，百合10g，丹參20g，丹皮15g，炒黃芩10g，徐長卿15g，防風(fēng)10g。全方補腎益氣、瀝濕化瘀，同時能調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)[15]，治療男性不育癥獲得明顯療效，但具體藥理機制不詳。傳統(tǒng)中醫(yī)認為“濕熱痰瘀”的形成多與外邪有關(guān)，如風(fēng)、寒、濕、（火）熱等，相當(dāng)于生物、物理、化學(xué)等多種因素的損傷。外邪引發(fā)病理產(chǎn)物積聚，內(nèi)環(huán)境狀態(tài)的改變，導(dǎo)致機體清除修復(fù)機制的障礙，進而形成瘀癥。p38MAPK信號途徑在此過程中發(fā)揮著重要作用，將受體傳遞的信號傳入細胞核內(nèi)，引發(fā)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，脫敏煎能有效抑制p38MAPK表達，提示脫敏煎可能通過對p38MAPK信號途徑的調(diào)節(jié)從而影響睪丸支持細胞Occludin表達以及BTB的開閉，同時亦提示脫敏煎可能通過下調(diào)p38MAPK的表達而治療免疫性不育癥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1能通過p38MAPK信號途徑而影響Occludin表達，中藥方劑脫敏煎能通過影響p38MAPK信號途徑調(diào)節(jié)睪丸支持細胞Occludin表達以及BTB的開閉，但TGF-β1的其他作用途徑以及脫敏煎治療男性不育癥的現(xiàn)代藥理學(xué)機制仍需進一步深入研究。