氧化應(yīng)激影響肝癌細胞糖異生關(guān)鍵基因表達的作用

肖 靖，胡澤明，康川川，袁邵強，周雯娜，黃 菲，陳 斌，鐘田雨，鐘佳寧

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2016級本科生；2.2017級碩士研究生；3.2016級碩士研究生；4.2015級本科生；5.科研中心;6.第一附屬醫(yī)院,江西 贛州 341000)

氧化應(yīng)激(Oxidative stress)是指在病理狀態(tài)下，活性氧產(chǎn)生量超過了內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，過多的自由基(如羥基自由基，超氧陰離子)堆積，使宿主一些生物大分子物質(zhì)，如DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等產(chǎn)生氧化作用[1]。普遍認為，氧化應(yīng)激的異常升高在體內(nèi)可能產(chǎn)生一種負面作用，并被認為是導(dǎo)致衰老和慢性疾病(心血管疾病、動脈粥樣硬化、代謝紊亂等)的一個重要誘導(dǎo)因素[2]。糖異生主要在肝[3]、腎[4]、小腸[5]中等通過一系列酶促反應(yīng)利用代謝中間產(chǎn)物(如乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等)重新合成葡萄糖，以維持空腹機體的基礎(chǔ)血糖水平。在空腹?fàn)顟B(tài)下肝臟通過糖異生輸出葡萄糖量約占全身血糖供應(yīng)量的65%[6]，因此在肝細胞(包括肝癌細胞)中糖異生反應(yīng)對血糖水平的調(diào)控(包括吸收血糖、糖原轉(zhuǎn)化和糖異生及輸出)具有重要作用。各種病因?qū)е碌母闻K氧化應(yīng)激水平升高常引起糖代謝異常，而糖代謝異常則影響肝臟疾病本身的病程進展和預(yù)后[7]。因此，我們深入研究氧化應(yīng)激如何調(diào)控糖代謝的作用機制有重要的意義。

GLUT4和G6PC兩個關(guān)鍵基因在調(diào)控糖異生反應(yīng)中起著重要作用。其中，GLUT4蛋白在肝癌細胞中具備類似于骨骼肌、心肌的應(yīng)激轉(zhuǎn)運能力,其能夠在應(yīng)激狀態(tài)下負責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運并在肝糖原的快速恢復(fù)過程中扮演著重要角色[8]。研究表明，在負責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族(Gluts)中唯有成員GLUT4能夠在機體應(yīng)激狀態(tài)下?lián)纹咸烟寝D(zhuǎn)運工作，提供機體在應(yīng)激狀態(tài)下所需的能量。GLUT4總蛋白水平與肝糖原濃度存在反比關(guān)系,即當(dāng)肝糖原濃度較低時GLUT4存在過表達,而肝糖原濃度較高時GLUT4低表達[9]。而葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)在糖代謝中也是參與糖異生和糖原分解過程的關(guān)鍵酶之一，廣泛分布于糖異生活躍的器官與組織中[10]。G6Pase可催化糖異生和糖原分解中的最后一步反應(yīng)，是肝葡萄糖生成的最后一步關(guān)鍵酶。

在肝臟中有多種轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控G6PC基因和GLUT4基因的表達。FOXO家族的一個關(guān)鍵成員，即叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box O 1，F(xiàn)OXO1)便是第一個被證明有此功能的轉(zhuǎn)錄因子[11]。在肝臟中，胰島素可以通過激活A(yù)KT抑制肝糖異生[12]，激活的AKT隨后在多個位點使FOXO1磷酸化，磷酸化的FOXO1與某些伴侶蛋白有更高的結(jié)合力，以便FOXO1從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，結(jié)果導(dǎo)致糖異生被抑制[13]。另有研究表明，F(xiàn)OXO1可以調(diào)節(jié)多種細胞活動如細胞凋亡與自噬、免疫調(diào)節(jié)及能量代謝[14]。FOXO1蛋白還參與其他的多種細胞功能，比如細胞增殖、衰老及對糖異生的應(yīng)激抗性[15]。因此，F(xiàn)OXO1也是維持細胞生命活動的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

本研究擬通過H2O2處理HepG2肝癌細胞，模擬細胞氧化應(yīng)激環(huán)境，觀察其在肝癌細胞中如何調(diào)控糖異生基因(G6PC、GLUT4)的表達變化并揭示其潛在作用機制。通過該研究能夠發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中氧化應(yīng)激對糖異生基因的影響，有助于深入了解肝癌細胞的代謝調(diào)控過程，為進一步研究氧化應(yīng)激如何誘導(dǎo)相關(guān)腫瘤代謝機制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑HepG2細胞株從中國科學(xué)院細胞庫購得。實驗所需主要試劑有RPMI1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素和細胞裂解液Trizol(美國Invitrogen公司)；30%H2O2(武漢純度生物公司)；SYBR Green試劑(美國Roche公司)；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Fermentas公司)；兔抗G6PC、GLUT4和FOXO1抗體(美國Millipore公司)；鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)鼠抗和兔抗(美國Sigma公司)；熒光羊抗兔偶聯(lián)抗體(美國Abcam公司)。qRT-PCR引物序列：G6PC.S GCAGGTGTATACTACGTGATGGT, G6PC.A GACATTCAAGCACCGAAATCTG；GLUT4.S GGGAAGGAAAAGGGCTATGCTG, GLUT4.A CAATGAGGAACCGTCCAAGAATG。

1.2細胞培養(yǎng)及藥物處理HepG2細胞在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其培養(yǎng)基用RPMI1640完全培養(yǎng)基(10%小牛血清、100 μg·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)，每2天進行傳代或保種。對照組用RPMI1640培養(yǎng)基處理，實驗組用配制好的H2O2(0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)處理。

1.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)將HepG2細胞傳于6孔盤，在對數(shù)生長期給藥處理，分為濃度梯度組2 h(0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)和時間梯度組2 mmol·L-1(0 h、1 h、2 h、4 h)兩組。給藥完成后消化細胞，取細胞沉淀用細胞裂解液(Trizol)提取RNA，并檢測RNA濃度和純度，用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA后通過SYBR Green試劑進行PCR擴增，再用GraphPad軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.4WesternBlot將HepG2細胞傳于6孔盤，在對數(shù)生長期給藥處理，分為濃度梯度組2 h(0 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)和時間梯度組2 mmol·L-1(0 h、2 h、4 h)兩組。給藥完成后消化細胞，取細胞沉淀制備成蛋白樣品，上樣、SDS-PAGE凝膠電泳、以250 mA恒流90 min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入G6PC、GLUT4或者β-Actin抗體，4 ℃過夜。TBST輕洗3次遍后加入二抗室溫孵育90 min，再用TBST清洗3遍后加入發(fā)光劑、顯影、定影，定量分析H2O2處理前后G6PC和GLUT4的蛋白表達。

1.5免疫熒光實驗備好滅菌的蓋玻片置于6孔盤中。將HepG2細胞傳于6孔盤中的6個格孔，使細胞貼壁于蓋玻片上，并將其分為3個對照組(RPMI1640處理)和3個實驗組(2 mmol·L-1H2O2處理)。在蓋玻片上生長的細胞用4%冰甲醇固定保持5 min，并用5%BSA/PBS封閉30 min。然后用一抗孵育細胞常溫1 h，再用PBST清洗3次，每次10 min。隨后，用熒光偶聯(lián)二抗孵育并進行相同的洗脫過程，最后用DAPI染核并洗脫，封片然后通過共聚焦顯微鏡下進行觀察。

2 結(jié) 果

2.1H2O2對糖異生關(guān)鍵基因G6PC和GLUT4轉(zhuǎn)錄表達的影響在H2O2處理的條件下，定量分析G6PC和GLUT4轉(zhuǎn)錄表達的情況，因此在傳有HepG2細胞的6孔盤里加入2 mmol·L-1的H2O2分別處理不同時間(0 h、1h、2 h、4 h)，提取RNA進行qRT-PCR檢測，如圖1A 所示，G6PC和GLUT4的mRNA相對表達量隨時間梯度顯著增高，但GLUT4的表達量在持續(xù)4 h H2O2處理后逐漸恢復(fù)；以及加入不同濃度(0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)的H2O2分別處理2 h，提取RNA進行qRT-PCR檢測，如圖1B所示，G6PC和GLUT4的mRNA相對表達量隨濃度梯度而增加。以上結(jié)果證明，糖異生關(guān)鍵基因G6PC和GLUT4轉(zhuǎn)錄表達是依賴于細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。

2.2H2O2作用HepG2肝癌細胞后G6PC和GLUT4蛋白水平的變化在H2O2處理的條件下，定量分析G6PC和GLUT4蛋白表達的情況，因此在傳有HepG2細胞的6孔盤里加入不同濃度(0 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)的H2O2分別處理2 h，提取樣本進行Western蛋白印跡檢測，如圖2A所示，G6PC和GLUT4的蛋白相對表達隨濃度梯度顯著降低；以及加入2 mmol·L-1的H2O2處理不同時間(0 h、2 h、4 h)，提取樣本進行Western蛋白印跡檢測，實驗結(jié)果如圖2B所示，G6PC和GLUT4的蛋白相對表達隨時間梯度顯著降低。實驗證明，細胞內(nèi)氧化應(yīng)激會誘導(dǎo)G6PC和GLUT4蛋白水平的降低。為了驗證在氧化應(yīng)激條件下，HepG2肝癌細胞的G6PC和GLUT4蛋白表達會受到影響，因此用免疫熒光實驗觀察G6PC和GLUT4在細胞內(nèi)的定位情況及蛋白表達情況。細胞貼于蓋玻片后給予含H2O2的培養(yǎng)基1 mL，使H2O2終濃度為2 mmol·L-1，處理時間為2 h。如圖3所示，H2O2處理后G6PC和GLUT4整體熒光亮度較對照組減弱，但核內(nèi)熒光亮度較對照組稍強。綜上，通過Western Blot和免疫熒光實驗我們都證明細胞內(nèi)氧化應(yīng)激確實能誘導(dǎo)G6PC和GLUT4蛋白水平的降低。

2.3H2O2對糖異生關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FOXO1蛋白在細胞內(nèi)定位表達的影響為了驗證氧化應(yīng)激對G6PC和GLUT4基因表達是通過影響其上游轉(zhuǎn)錄因子的表達而進行調(diào)控，因此用免疫熒光實驗觀察FOXO1在細胞內(nèi)的定位情況。細胞貼于蓋玻片后給予含H2O2的培養(yǎng)基1 mL，使H2O2終濃度為2 mmol·L-1，處理時間為2 h。如圖4所示，H2O2處理后FOXO1胞質(zhì)熒光亮度較對照組增強，核內(nèi)熒光亮度較對照組減弱。實驗證明，氧化應(yīng)激確實會誘導(dǎo)FOXO1從細胞質(zhì)進入細胞核內(nèi)。這一定位的改變會導(dǎo)致其調(diào)控功能的轉(zhuǎn)換。

(A)qRT-PCR檢測用2 mmol·L-1 H2O2處理不同時間梯度的G6PC和GLUT4基因的mRNA相對表達量；

(A)Western Blot檢測用不同濃度梯度的H2O2處理2 h后G6PC和GLUT4的蛋白表達；

(A)使用G6PC抗體對用或不用H2O2處理的HepG2肝癌細胞進行免疫熒光染色，細胞核用DAPI染色；

使用FOXO1抗體對用或不用H2O2處理的HepG2肝癌細胞

3 討 論

長期以來，有大量研究揭示了肝癌細胞與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系,比如辣椒素能劑量依賴性誘導(dǎo)HepG2 肝癌細胞的凋亡，其機制與氧化應(yīng)激水平過激活相關(guān)[16]；雷公藤甲素刺激了肝癌細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而使細胞發(fā)生凋亡[17]。但目前氧化應(yīng)激對肝癌細胞糖代謝方面的研究知之甚少，因此，為了研究氧化應(yīng)激在肝癌細胞中調(diào)控糖異生的作用機制，我們設(shè)計H2O2來模擬氧化應(yīng)激環(huán)境，檢測HepG2 肝癌細胞中的糖異生關(guān)鍵基因的表達情況，我們的結(jié)果顯示，G6PC和GLUT4的轉(zhuǎn)錄表達增高，而蛋白表達降低；以及FOXO1蛋白含量在胞質(zhì)里明顯增高。這些實驗結(jié)果表明了氧化應(yīng)激能促進肝癌細胞FOXO1蛋白的表達，從而上調(diào)G6PC和GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄，進一步證實了氧化應(yīng)激能促進糖異生的發(fā)生。但由于在氧化應(yīng)激條件下，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)可能通過構(gòu)象改變而受到破壞或降解[18]，因此在我們的實驗中，G6PC和GLUT4的蛋白表達是降低的，這與它們的轉(zhuǎn)錄表達增高并不矛盾。

已有研究表明FOXO1可以通過激活多種基因的表達來促進糖異生，它的活性與其翻譯后修飾緊密相關(guān)，其中包括磷酸化、泛素化和乙?；痆19]。FOXO1蛋白分布在細胞核和細胞質(zhì)組分中，細胞核中的非磷酸化FOXO1蛋白可以激活各種糖異生基因的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)FOXO1磷酸化后，它從細胞核移位至細胞質(zhì)，從而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性喪失[20]。有體外實驗表明，氧化應(yīng)激增強了FOXO1蛋白的表達，并抑制FOXO1蛋白磷酸化，隨后增強了PEPCK的表達[21]。PEPCK是糖異生調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶以及FOXO1的下游效應(yīng)因子，降糖藥物可以通過抑制FOXO1來降低PEPCK的表達，從而實現(xiàn)線粒體功能的增強以及控制肝臟中的血糖保持在穩(wěn)定水平[22]。另有研究表明，氧化應(yīng)激增強了FOXO1在多核巨細胞中的轉(zhuǎn)錄活性，增強了FOXO1在胞質(zhì)中的表達[23]。在我們的細胞實驗中，氧化應(yīng)激導(dǎo)致部分FOXO1蛋白定位從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，從而增強了糖異生G6PC和GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄，這與他們的實驗結(jié)果相似。

FOXO1還參與2型糖尿病(T2DM)患者的胰島素抵抗和細胞因子介導(dǎo)的β細胞衰竭，并導(dǎo)致糖異生、細胞凋亡、不受控制的自噬以及細胞周期停滯[24]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)抗糖尿病藥物和AM251可以通過抑制FOXO1來下調(diào)PEPCK和G6PC的表達，從而控制肝臟中的血糖保持在穩(wěn)定水平[25]。與此相似的是，我們的研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以促進腫瘤細胞的FOXO1表達增高，從而上調(diào)G6PC和GLUT4的表達，于是可以推測某些抗氧化應(yīng)激藥物可能會抑制腫瘤細胞糖異生的發(fā)生，這可能為治療伴有2型糖尿病的腫瘤患者提供了一種重要理論依據(jù)。但由于體外實驗不能完全模擬體內(nèi)實驗的氧化應(yīng)激環(huán)境，我們的實驗結(jié)果受到一定程度的限制，未來我們將構(gòu)建小鼠模型來展開進一步的研究。