赤霉素G A3對(duì)貫葉連翹試管苗玻璃化現(xiàn)象的影響

貫葉連翹為藤黃科金絲桃屬植物，多年生草本，又名貫葉金絲桃。貫葉連翹在藥用和觀賞方面的應(yīng)用已引起了人們的廣泛關(guān)注，但其野生資源種群數(shù)量少，種子數(shù)量有限，近年來作為藥源，人為采挖較為嚴(yán)重，為有效保護(hù)野生資源，大力開展貫葉連翹的繁育工作勢(shì)在必行，利用組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖，是促進(jìn)貫葉連翹良種繁育的有效途徑。但貫葉連翹初代誘導(dǎo)過程中玻璃化問題較為嚴(yán)重，為解決這一問題，項(xiàng)目組在改善其它培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上著重研究了不同濃度的赤霉素(GA3)對(duì)貫葉連翹試管苗分化和發(fā)育的影響，以期獲得玻璃化現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)。

一、材料與方法

（一）材料

4月中下旬在甘肅省小隴山林區(qū)選擇無病蟲害、生長(zhǎng)正常的貫葉連翹頂部嫩梢先端2～3厘米的莖段作為繁殖材料。

（二）方法

1.赤霉素 (GA3)母液的配制 稱取赤霉素GA3 0.1克，溶于1摩爾每升熱的氫氧化鈉溶液中，待完全溶解后轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加水定容至100毫升，即得濃度為1毫克每毫升的母液。按實(shí)驗(yàn)要求每次吸?。?.1，0.2，0.4，0.5，0.8，1.0）毫升母液于 1 升 MS 培養(yǎng)基中，即可配成含（0.1，0.2，0.4，0.5，0.8，1.0）毫克每升赤霉素GA3的MS固體培養(yǎng)基。

2.接種 試驗(yàn)材料在自來水下將其表面灰塵沖洗干凈，在無菌條件下，用75%酒精浸泡30秒，無菌水沖洗3次。在含有0.1%的吐溫-80的0.1%HgCl2溶液中滅菌5分鐘，滅菌過程中要不時(shí)搖動(dòng)，最后用無菌水沖洗4～5次，吸干水分。用剪刀剪出1.5厘米長(zhǎng)莖段（含1～2節(jié)間）接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行初代培養(yǎng)。

3.試驗(yàn)設(shè)計(jì) 初代培養(yǎng)基中加入2，4-D（2.0毫克每升），待愈傷組織形成后，小心切去帶有生長(zhǎng)點(diǎn)的愈傷組織，以MS為基本培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代增殖，誘導(dǎo)芽萌發(fā)和促進(jìn)芽的生長(zhǎng)。設(shè)計(jì)6個(gè)處理（即在同樣生長(zhǎng)條件下，在培養(yǎng)基 MS+6-BA3.0+2，4-D2.0+GA3（單位均為毫克每升），對(duì)6種不同濃度GA3溶液（0.1，0.2，0.4，0.5，0.8，1.0）毫克每升處理的貫葉連翹，3次重復(fù)；誘導(dǎo)叢生芽的形成和生長(zhǎng)，每個(gè)培養(yǎng)瓶植入6個(gè)單芽，每重復(fù)10瓶。30天后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每處理叢生芽玻璃化情況，每處理每重復(fù)隨機(jī)抽取3個(gè)培養(yǎng)瓶，清洗掉培養(yǎng)基，將誘導(dǎo)形成的芽置于超凈工作臺(tái)上，采用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量不定芽自然長(zhǎng)度，精度0.1厘米。

4.培養(yǎng)條件 上述培養(yǎng)基均添加3%蔗糖和0.7%瓊脂，pH值為5.6～5.8之間，培養(yǎng)溫度為（20±2）℃，光照強(qiáng)度為1000～1500LX，每日光照12小時(shí)。

5.培養(yǎng)及觀察 接種完畢后將三角燒瓶置于26～28℃的恒溫培養(yǎng)箱中，光照條件下培養(yǎng)，每天觀察記錄發(fā)芽情況，待幼苗長(zhǎng)出2片子葉時(shí)，在超凈臺(tái)上將幼苗移植到添加有不同濃度GA3的MS固體培養(yǎng)基中，26～28℃繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從移植的第二天開始進(jìn)行芽苗的高度的測(cè)量以及玻璃化的觀察。每種濃度處理取幼苗進(jìn)行測(cè)量及觀察，3次重復(fù)，取其平均值。

二、結(jié)果與分析

（一）不同濃度赤霉素（GA3）溶液對(duì)貫葉連翹芽苗的影響

四周后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，GA3具有促進(jìn)貫葉連翹芽苗生長(zhǎng)的作用，且不同濃度的GA3溶液對(duì)貫葉連翹芽苗的生長(zhǎng)影響不同，平均芽苗高度4.53厘米，總體表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)，具體情況見圖（1、2）。

圖2 不同濃度的GA3對(duì)貫葉連翹芽苗玻璃化程度的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)貫葉連翹芽苗玻璃化抑轉(zhuǎn)最有效的GA3濃度為0.5毫克每升，低于此濃度，效果不顯著，但濃度大于0.5毫克每升時(shí)，苗莖細(xì)弱，基部切口變黑，葉片皺縮，且隨著濃度升高，芽苗高生長(zhǎng)呈明顯下降趨勢(shì)，而降低GA3濃度可恢復(fù)正常。

（二）不同濃度赤霉素（GA3）溶液對(duì)貫葉連翹芽苗玻璃化的影響

增殖培養(yǎng)結(jié)果表明，在GA3的濃度分別為（0.1，0.2，0.4，0.5，0.8，1.0）毫克每升的 6 個(gè)配比進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)中，不同濃度的GA3溶液的作用下，玻璃化程度差別較大，隨著GA3的濃度不斷增大，貫葉連翹則芽苗的玻璃化呈現(xiàn)中間小兩頭大的趨勢(shì)。總體結(jié)果顯示：在0.5毫克每升的GA3溶液處理下，玻璃化程度較低，芽苗分化較好。

三、結(jié)論與討論

玻璃化苗是植物內(nèi)部生理失調(diào)的外在表現(xiàn)，它是在試管內(nèi)控制條件下培養(yǎng)植物的產(chǎn)物，玻璃化多為組培過程中措施不當(dāng)造成的非遺傳的生理性失調(diào)癥狀，是人工提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不完全符合培養(yǎng)物固有需要的結(jié)果。

在貫葉連翹組培快繁實(shí)施過程中，玻璃化問題嚴(yán)重阻礙了試驗(yàn)的進(jìn)程和芽苗的質(zhì)量，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，輕度玻璃化苗轉(zhuǎn)入無添加激素的MS培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)1～2代，可恢復(fù)正常，而主莖已完全玻璃化時(shí)則不能逆轉(zhuǎn)。采用MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的GA3，對(duì)貫葉連翹幼苗的生長(zhǎng)均有不同程度的促進(jìn)作用，其中0.5毫克每升的GA3極顯著地提高了幼苗的高度，降低了玻璃苗的比率。