高景凱， 趙前程， 孫佳琦， 苗永美

(安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100)

植物內生菌(Endophytes)是指那些生活史的一定或全部階段生活于健康植物的組織和器官內部的真菌、細菌或放線菌,可通過組織學方法或從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生[1-2]。內生菌分布非常廣泛,內生菌與宿主植物在長期的進化過程中形成了互惠共生的關系[3]?；趦壬N類多樣性、代謝途徑的豐富性和能夠獨立合成和促進寄主合成結構新穎、活性多樣的化合物等原因,內生菌是生產(chǎn)天然產(chǎn)物的重要來源[4-6]。

石豆蘭為蘭科石豆蘭屬(Bulbophyllum)多年生常綠匍匐小草本植物,全草或假鱗莖皆可入藥[7],具有祛風除濕,消腫止痛,涼血活血、抗癌等功效[8-9]。由于環(huán)境污染問題和過度采挖,石豆蘭自然數(shù)量日益減少。因此,大力發(fā)展人工種植石豆蘭,研究其藥用成分及生物價值成為石豆蘭產(chǎn)業(yè)的一門重要課題。石豆蘭組織組培和細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),石豆蘭內生菌豐富,有些菌株能與寄主離體共培養(yǎng),進一步證明了內生菌在促進蘭科植物種子萌發(fā)、供應營養(yǎng)物質及促進幼苗生長等方面起重要作用的觀點[10-11]。

植物內生菌豐富,蘊含著優(yōu)異基因,是天然產(chǎn)物的重要來源,故研究火熱,并取得重大進展。關于石豆蘭內生菌多樣性未見報道,本研究以福建南屏的廣東石豆蘭(BulbophyllumkwangtungenseSchltr.) 為材料進行內生菌分離,研究內生菌及其代謝產(chǎn)物的應用價值,以期獲得優(yōu)良菌株,為進一步豐富和開發(fā)內生菌資源提供初步前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

石豆蘭采自福建南屏鴛鴦獼猴自然保護區(qū),由安徽科技學院從事植物學教學與科研的王玉良副教授鑒定為廣東石豆蘭。病原菌為致棉花枯萎的尖孢鐮刀菌萎蔫?；?Fusariumoxysporumf.sp. vasinfectum)和致黃瓜枯萎的尖孢鐮刀菌萎蔫?；?Fusariumoxysporumf.sp cucumerinum),由本校農學院段海明博士提供。

分離培養(yǎng)基共7種:NA培養(yǎng)基(牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母膏1 g、葡萄糖10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L、pH 7.0～7.2);金氏培養(yǎng)基(蛋白胨20 g、甘油10 g、瓊脂15 g、K2HPO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、蒸餾水1 L、pH 7.2);YPD培養(yǎng)基(酵母提取物10 g、蛋白陳20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L、pH 7.2);LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、酵母膏5 g、瓊脂15 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 L、pH 7.0);大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、大豆胨5 g、瓊脂15 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 L、pH 7.2～7.4);YG培養(yǎng)基(酵母膏3 g、胰蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L、pH 9.0);R2A培養(yǎng)基(酵母粉0.5 g、胰蛋白胨0.25 g、葡萄糖0.5 g、淀粉0.5 g、丙酮酸鈉0.3 g、瓊脂15 g、K2HPO40.3 g、MgSO40.024 g、pH 7.0～7.4)。以上培養(yǎng)基均經(jīng)過121 ℃滅菌15 min,備用。

1.2 方法

1.2.1 內生細菌的分離、純化與保存 材料經(jīng)過清洗,稱取葉片、假鱗莖、橫走莖、根4種器官各1 g,分別用75%的酒精處理30 s,無菌水清洗3次,再用0.1%HgCl2消毒8 min,無菌水洗滌5次。取最后一次洗滌水涂平板,培養(yǎng)3 d,確定外植體表面是否消毒徹底。將表面消毒徹底的材料切碎,按1∶20比例加入無菌水研磨成勻漿。4種研磨原液依次稀釋成1×10-1、1×10-2、1×10-3共3個梯度,渦旋混勻,吸取100 μL涂布于7種分離培養(yǎng)基上,每個濃度涂布3個皿,培養(yǎng)4 d。依據(jù)顏色、大小、形態(tài)等特征統(tǒng)計數(shù)量和種類,并挑單菌落,劃線純化保存。

1.2.2 內生細菌的分子鑒定 菌株基因組DNA提取參照苗翠蘋的方法[12],采用16S rRNA基因的通用引物進行PCR擴增,引物序列如下:

PA:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’(對應E·coli的7-24位堿基)

PB:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’(對應E·coli的1 540-1 522位堿基)

PCR擴增體系及擴增程序參照苗翠蘋的方法[12],擴增產(chǎn)物送至上海生工進行測序。將測序結果使用EzBioCloud(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)在線比對工具進行序列分析,確定各菌株的有效發(fā)表近緣種。從Genbank中調取相似性高的近緣種的16S rRNA基因序列,用Clustal X進行多重序列比對,通過MEGA 7.0軟件選用Kimura2-parameter距離模型計算進化距離,采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,1 000次隨機抽樣計算Bootstrap值以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。

1.2.3 對峙抑菌試驗 采用菌落對峙法對分離到的38株細菌進行抑制棉花枯萎病和黃瓜枯萎病原菌初篩試驗。直徑為9 cm的培養(yǎng)皿,制作PDA平板,在直徑線上距皿邊緣2.5 cm處分別接內生菌、棉花枯萎病原菌或黃瓜枯萎病原菌,使內生細菌和病原菌形成相距4 cm的對峙狀態(tài),于28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察病原菌生長狀況,對照和處理都重復3次。

1.2.4 內生細菌代謝產(chǎn)物抑菌試驗 對峙抑菌試驗篩選到有抑菌效果的內生菌,從試管斜面刮取一環(huán)接種到5 mL液體LB中,30 ℃震蕩培養(yǎng)過夜得種子液。按2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖瓶裝量25 mL/50 mL,30 ℃,180 r/min培養(yǎng)3 d,10 000 r/min離心20 min,取上清依次經(jīng)過0.45 μm和0.22 μm無菌微孔濾膜過濾得發(fā)酵濾液。6 mL發(fā)酵濾液與54 mL PDA混合均勻倒3個平板(9 cm)。病原菌經(jīng)過活化長滿平皿后,用直徑0.8 cm的打孔器沿邊緣一圈打菌餅,將菌餅倒扣在平板中央,以不加發(fā)酵液PDA為對照,28 ℃培養(yǎng)4 d,十字交叉法測量菌落直徑,平均值為菌落直徑。計算抑菌率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。

2 試驗結果及分析

2.1 內生細菌的分離

表1 不同器官不同培養(yǎng)基上內生菌的株數(shù)

試驗結果表明,0.1%HgCl2消毒8 min能殺死外植體表面微生物,10-3是分離、容易挑取單菌落的最佳稀釋梯度。不同器官不同培養(yǎng)基上分離到的菌株數(shù)不同(表1),從四種器官分離到的菌株數(shù)由多到少順序:假鱗莖>橫走莖>根>葉;8種分離培養(yǎng)基分離得到菌株數(shù)最多的是LB培養(yǎng)基,明顯高于其它七種培養(yǎng)基,說明LB培養(yǎng)基適合絕大多數(shù)內生細菌的生長,因此,后面的試驗采用LB為基礎培養(yǎng)基。對分離到的內生細菌在初步形態(tài)鑒定的基礎上進行分子學鑒定,共39種。根據(jù)圖1系統(tǒng)進化樹可以將39種菌分為兩大類群。第一大類群為厚壁菌門(Firmicutes),涉及3科4屬,共34種(表2)。有芽孢桿菌科(Bacillaceae)的芽孢桿菌屬(Bacillus,30種,76.92%)和賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus,1種,2.56%),類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)的類芽孢桿菌屬(Paenibacillus,2種,5.13%),葡萄球菌科(Staphylococcaceae)的葡萄球菌屬(Staphylococcus,1種,2.56%);第二大類為γ-變形菌門(γ-Proteobacteria),涉及2科4屬5種,有腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的腸桿菌屬(Enterobacter,2種,5.13%)、勒克菌屬(Leclercia,1種,2.56%)、科薩克氏屬(Kosakonia,1種,2.56%)和假單孢菌科(Pseudomonadaceae)的假單孢菌屬(Pseudomonas,1種,2.56%)。

表2 石豆蘭內生細菌與其相似菌株的分析及抑菌活性

注:Ah和Am是分別表示對峙法對黃瓜枯萎病菌和棉花枯萎病菌的抑菌率,Bh和Bm是分別是發(fā)酵液法對黃瓜枯萎病菌和棉花枯萎病菌的抑菌率,“-”代表無抑菌活性

圖1 石豆蘭內生細菌分離株16S rRNA系統(tǒng)進化樹

2.2 內生細菌抑菌結果

對峙法抑菌試驗結果表明(表2),39株內生細菌中對黃瓜枯萎病原菌具有抑制作用的有16株,對棉花枯萎病原菌具有抑制作用有14株,對兩種病原菌都有抑制作用的有10株。將初步篩選出具抑菌功能的陽性菌株,用LB為基礎培養(yǎng)基發(fā)酵3 d,其無菌濾液經(jīng)PDA稀釋10倍后,接種兩種病原菌。結果表明發(fā)酵產(chǎn)物對對黃瓜枯萎病原菌具抑制功能的有13株,抑菌率在3.36%～40.38%之間,其中BK15號抑菌率最高,對棉花枯萎病原菌具抑制功能的有13株,抑菌率在5.77%～60.78%之間,BK26號菌抑菌率最高。編號BK1、BK3、BK8、BK15、BK19、BK23、BK31共7株菌對兩種病原菌均有抑制功能。

圖2 對棉花枯萎病和黃瓜枯萎病菌絲生長抑制效果

圖3 發(fā)酵產(chǎn)物對棉花枯萎病和黃瓜枯萎病菌絲生長抑制效果

3 結論與討論

本研究前期預實驗確定廣東石豆蘭表面消毒方式是用0.1%HgCl2處理8 min,此條件足可以殺死表面微生物。表面消毒方式對確保分離到的菌是否內生至關重要,消毒方式與材料種類、來源、部位等因素有關,不同植物采取的消毒方式不同[13],因此,分離內生菌之前先確定消毒方式,即保證能殺死表面微生物,又不傷害內部菌。本研究選用了四種器官進行內生菌分離,不同器官含細菌的豐富程度不同,假鱗莖內生菌含量最為豐富,在8種培養(yǎng)基上分離到菌最多,橫走莖次之,葉最少;可能是因為假鱗莖是石豆蘭的藥食部位,生長周期長,營養(yǎng)豐富,其內生環(huán)境適合細菌生長,而葉片革質,組織成分較為單一,不太適合內生菌的繁殖。而在鐵皮石斛中,根部分離到的內生菌數(shù)量多于莖和葉部[14]。

基于不同內生菌需要不同的生長環(huán)境,設計了8種分離培養(yǎng)基[15-16],四種器官均利用LB培養(yǎng)基分離得到菌株數(shù)最多,菌株數(shù)明顯高于其它七種培養(yǎng)基,說明LB培養(yǎng)基適合廣東石豆蘭絕大多數(shù)內生細菌的生長。本研究結果表明,從廣東石豆蘭分離到的內生細菌種類并不多,經(jīng)過16S rRNA比對共有39株內生細菌,可能因為廣東石豆蘭內生菌材料來源單一,生長條件苛刻,大多數(shù)不可培養(yǎng)。39株菌歸屬厚壁菌門(Firmicutes)和γ-變形菌門(γ-Proteobacteria),植物分離結果與Galdiano等[17]、俞婕等[18]從蘭科植物種分離的內生菌結果類似,其中芽孢桿菌屬(Bacillus)最多,占76.92%,這與楊娜等從蘭科植物中分離得到的內生細菌種群優(yōu)勢的結果較為一致[19]。同時分離出的內生細菌中還有假單胞菌屬,這與嚴亮等[14]對云南鐵皮石斛內生細菌的鑒定結果較為一致。對篩選到的內生菌選用對峙法初步篩選出抑制黃瓜枯萎病原菌和棉花枯萎病原菌的菌株,用其發(fā)酵液進行復篩,對兩種病菌具抑制作用各有13株,占分離菌株的33.33%,其中7株兼有抑制兩種病菌的作用,說明廣東石豆蘭內生菌可作為生防菌用于農作物病害的防治。

綜上所述,本研究結果表明,廣東石豆蘭體內擁有一定豐富度的內生細菌資源,33.33%內生菌對黃瓜枯萎病原菌或棉花枯萎病原菌有抑制作用,17.95%內生菌對兩種病菌都具抑制作用。研究結論為廣東石豆蘭內生菌資源的生物活性物質篩選以及開發(fā)利用提供了基礎理論依據(jù)。