孫旦　李玉琴　丁瑩　雷小麗　駱亞麗　周衛(wèi)芳

【摘要】 目的 探討miRNA-492在兒童支原體肺炎中的作用，進(jìn)一步了解支原體感染的免疫致病機(jī)制。方法 選取2014年3月至2015年6月期間住院治療，確診為肺炎支原體肺炎患兒23例作為實(shí)驗(yàn)組（MPP組），同時(shí)期健康兒童20例作為對照組（NC組），采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6，RT-qPCR法檢測HMGB1及miRNA-492的表達(dá)量，分析兩組實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、免疫球蛋白水平及淋巴細(xì)胞亞群分布，探討miRNA-492與TNF-α、IL-6、HMGB1及其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果 肺炎支原體肺炎組患兒外周血miRNA-492、TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)水平均高于健康對照組（P<0.05）。MPP組miRNA-492與Neut、Lymph、CRP、AST、LDH、HBDH、PA、IgA、IgG、CD3+CD4+百分比、NK 細(xì)胞百分比、CD19+CD23+百分比、TNF-α、IL-6均無明顯相關(guān)性（P>0.05），與HMGB1呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。結(jié)論 miRNA-492、TNF-α、IL-6及HMGB1在肺炎支原體肺炎感染和發(fā)病中起一定作用，作用機(jī)制可能不同。

【關(guān)鍵詞】 肺炎支原體肺炎;miRNA-492;TNF-α;IL-6;HMGB1

中圖分類號(hào)：R725.6? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.06.006

【Abstract】 Objective To investigate the role of miRNA-492 in children with mycoplasma pneumoniae pneumonia and to further understand the immune pathogenic mechanism of mycoplasma infection.Methods 23 children diagnosed with mycoplasma pneumonia during hospitalization from March 2014 to June 2015 were selected as experimental group（MPP group），and 20 healthy children in the same period were selected as control group（NC group）.And then，TNF-α and IL-6 were detected by ELISA，and the expression of HMGB1 and miRNA-492 by RT-qPCR.The results of laboratory examination，immunoglobulin levels and the distribution lymphocyte of subsets in the two groups were analyzed.In addition，correlation between miRNA-492 and TNF-α，IL-6，HMGB1 and other laboratory indexes was explored.Results The expressions of microRNA492，TNF-α，IL-6 and HMGB1 in peripheral blood of children with mycoplasma pneumoniae pneumonia were higher than those of healthy control group（P<0.05）.In the MPP group，miRNA-492 was not obviously correlated with TNF-α，IL-6，Neut，Lymph，CRP，AST，LDH，HBDH，PA，IgA，IgG and the percentages of CD3+CD4+，NK cell and CD19+CD23+（P>0.05），but it was negatively correlated with HMGB1（P<0.01）.Conclusion MiRNA-492，TNF-α，IL-6 and HMGB1 play certain roles in the immune pathogenesis of mycoplasma pneumoniae pneumonia，but their mechanisms of action may be different.

【Key words】 mycoplasma pneumoniae pneumonia;miRNA-492;TNF-α;IL-6;HMGB1

肺炎支原體（MP）是兒童社區(qū)獲得性肺炎的常見病原菌，體液免疫、細(xì)胞免疫和細(xì)胞因子在肺炎支原體肺炎（MPP）發(fā)病機(jī)制中起到重要作用[1～4]。小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，miRNA-492是靈長類動(dòng)物特有的miRNA[5]。miRNA-492可調(diào)控多種蛋白表達(dá)，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移、胰島素抵抗、自身免疫等生物進(jìn)程中起到重要作用，在支原體感染中鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2014年3月至2015年6月期間在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院治療，確診為肺炎支原體肺炎患兒23例作為研究對象（MPP組），同期健康體檢兒童20例作為對照（NC組），入院后采集2 mL外周血，ELISA法檢測TNF-α、IL-6，RT-qPCR法檢測HMGB1及miRNA-492的表達(dá)量，回顧性分析其實(shí)驗(yàn)室檢查、免疫球蛋白水平檢測及淋巴細(xì)胞亞群檢測。其中MPP組患兒男14例，女9例，平均年齡（6.72±2.93）歲;NC組健康兒童男11例，女9例，平均年齡（6.42±2.67）歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MPP組所有入選病例符合肺炎支原體肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，排除常見的病毒、衣原體、結(jié)核菌的感染以及腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、胰島素抵抗、自身免疫性疾病。NC組符合下列條件：同時(shí)期內(nèi)無器質(zhì)性疾病、3個(gè)月內(nèi)無急性感染性疾病史的健康兒童。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有病例入院后次日清晨采集空腹抗凝血2 mL，2小時(shí)內(nèi)4℃，2500 rpm離心10分鐘，吸取上層黃色血漿-80℃凍存。剩余血細(xì)胞按紅細(xì)胞裂解法分離獲得白細(xì)胞，加入1 mL Trizol吹打混勻得到白細(xì)胞Trizol混合液，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miRNA-492的表達(dá) 23例MPP組及20例NC組的白細(xì)胞Trizol混合液冰上溶解，提取并純化RNA，分光光度計(jì)測定RNA的質(zhì)量和濃度。miRNA-492以U6為內(nèi)參，HMGB1以β-actin為內(nèi)參，按照灝勤生物公司miRNA/mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒說明書測定樣本中miRNA-492及HMGB1的表達(dá)，采用相對表達(dá)量2-△△Ct法比較各基因的表達(dá)差異。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群 淋巴細(xì)胞亞群的檢測運(yùn)用BD FACSCalibur公司流式細(xì)胞儀進(jìn)行多參數(shù)分析。

1.2.4 ELISA 檢測 采用聯(lián)科生物技術(shù)公司 ELISA試劑盒檢測血漿 TNF-α、IL-6表達(dá)水平，具體操作方法嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件包，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分比或率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearson秩相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)? 果

2.1 MPP組患兒與NC組兒童實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 兩組兒童實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較共有12項(xiàng)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。見表1。

2.2 MPP組患兒與NC組兒童miRNA-492及細(xì)胞因子比較 MPP組患兒外周血miRNA-492、TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)水平均高于NC組兒童，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 miRNA-492水平與差異表達(dá)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及細(xì)胞因子相關(guān)性 MPP組miRNA-492與Neut、Lymph、CRP、AST、LDH、HBDH、PA、IgA、IgG、CD3+CD4+百分比、NK 細(xì)胞百分比、CD19+CD23+百分比、TNF-α、IL-6均無明顯相關(guān)性（P>0.05），與HMGB1呈負(fù)相關(guān)（P< 0.01）。見表3。

3 討? 論

肺炎支原體肺炎曾被當(dāng)作一種自限性疾病，并不受到重視。但近年來，難治性肺炎支原體肺炎及支原體肺炎造成的肺外并發(fā)癥也可能給患者造成嚴(yán)重的組織器官損傷;同時(shí)也有研究表明，肺炎支原體的感染可能與哮喘發(fā)病密切相關(guān)[7]。本組支原體肺炎患兒外周血CRP、中性粒細(xì)胞數(shù)等炎性指標(biāo)明顯增高，淋巴細(xì)胞數(shù)降低、前白蛋白減少明顯，考慮與MP感染后引起機(jī)體較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。MP感染后易引起肺外損傷，其中以肝功能及心臟損傷最為多見。本組支原體肺炎患兒外周血HBDH、LDH、AST增高，心肌酶的增高考慮與MP感染導(dǎo)致的免疫激活相關(guān)。

免疫機(jī)制在肺炎支原體的感染和MPP發(fā)病過程中起到了重要的作用，目前尚未完全明了。一方面，肺炎支原體可在體內(nèi)誘發(fā)體液免疫應(yīng)答，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，形成免疫復(fù)合物。另一方面，肺炎支原體的表面抗原與人體多種組織器官表面抗原相似，還可改變部分人體細(xì)胞表面抗原表達(dá)，誘發(fā)免疫細(xì)胞對自身組織的攻擊[8]，導(dǎo)致被感染者免疫紊亂。

TNF-α是機(jī)體重要的內(nèi)源性炎癥因子，文獻(xiàn)報(bào)道TNF-α參與重癥肺炎所致的肺損傷[9]，本研究結(jié)果顯示MPP組患兒的TNF-α水平高于NC組，提示TNF-α參與了肺炎支原體肺炎的發(fā)病過程。IL-6水平增高是最早出現(xiàn)的感染指標(biāo)。IL-6是MPP炎癥反應(yīng)中的重要細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答的早期即發(fā)揮重要作用[10]。本研究結(jié)果顯示MPP組患兒的IL-6高于NC組，提示IL-6參與了肺炎支原體肺炎的發(fā)病過程。HMGB1是一種保守的非組蛋白核蛋白，尹力等人[11]研究顯示HMGB1在肺炎患者血液中高度表達(dá)（P<0.05），可能提示疾病的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示MPP患兒血漿HMGB1的含量明顯高于健康對照組，提示HMGB1參與了肺炎支原體肺炎的發(fā)病過程。

miRNA作為近年來備受關(guān)注的一類內(nèi)源性非編碼小RNA，在多種生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)比較MPP組與NC組兒童外周血血漿中miRNA的表達(dá)譜，篩選出26條差異表達(dá)的miRNAs，19條miRNAs上調(diào)，7條miRNAs下調(diào)，提示miRNAs參與機(jī)體對肺炎支原體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并對miRNA-492 及miRNA-222-3P進(jìn)行了驗(yàn)證[12]。

miRNA-492位于12q22染色體上，序列為AGGACCUGCGGGACAAGAUUCUU，是靈長類動(dòng)物特有的miRNA，在腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移及胰島素抵抗等生物過程中起重要作用，同時(shí)，由于miRNA在組織細(xì)胞內(nèi)和外周血液系統(tǒng)中均有存在，并且不受內(nèi)源性RNA酶的影響，穩(wěn)定性較好，因此，亦有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA-492可作為生物標(biāo)記物，用于疾病的診斷中[13]。但在支原體肺炎的診斷敏感性和特異性未做ROC曲線分析，因樣本量較小，且除了健康對照組以外還需要做一些病毒性、細(xì)菌性肺炎標(biāo)本作為對照才有意義。miRNA-492在感染性疾病的研究甚少，RT-PCR結(jié)果顯示，與健康對照兒童相比，miRNA-492在肺炎支原體患兒的外周血中水平顯著升高，推測miRNA-492在肺炎支原體肺炎發(fā)病過程中起到一定作用。然而，本研究將miRNA-492水平與肺炎支原體肺炎患兒差異表達(dá)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及炎癥因子進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-492與HMGB1呈負(fù)相關(guān)，與其他指標(biāo)無相關(guān)性。究其原因，可能是由于miRNAs的調(diào)控作用是一系列非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，具有較強(qiáng)的時(shí)間性和空間性，所以，miRNA-492和肺炎支原體肺炎患兒的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、TNF-α、IL-6的調(diào)節(jié)并不具有明顯相關(guān)性，而HMGB1作為晚期炎癥因子在炎癥反應(yīng)中常常出現(xiàn)得比較晚，在支原體感染中的研究也極少，且本次研究病例較少，生物學(xué)信息分析miRNA-492下游的靶基因較多，是否存在哪一個(gè)靶基因調(diào)節(jié)HMGB1的表達(dá)在今后的實(shí)驗(yàn)中有待進(jìn)一步研究。