韓暢　蔣琪　高智席　呂朝燕　胡海軍　古榮斌

摘 要 對16份貴州省主要辣椒品種的辣椒素含量進(jìn)行鑒定，并成功克隆了導(dǎo)致辣椒素含量差異性狀的PUN1（AT3）基因的2個等位基因（AT3-D1和AT3-D2）。實驗結(jié)果表明：在16個辣椒品種中，辣椒素含量最高的是單生理想和正椒12號，分別達(dá)到3 323.11 ng·mL-1和3 160.52 ng·mL-1;最低的是干椒3號和辛香15號，分別只有759.3 ng·mL-1和583.28 ng·mL-1。選取單生理想和辛香15號作為材料克隆控制辣椒素含量的關(guān)鍵基因（AT3-D1和AT3-D2），AT3-D1比AT3-D2在蛋白質(zhì)的N端少了100個氨基酸，但是在此后序列中具有較高的同源性，整體一致性達(dá)到67.35%;二者的蛋白分子量分別為37.79 kD和49.68 kD，等電點（pI）分別為6.95和7.09，均屬于穩(wěn)定蛋白和非分泌蛋白，且都不屬于跨膜蛋白。

關(guān)鍵詞 辣椒素;高效液相色譜;pun1基因;基因克隆

中圖分類號：S641.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.08.078

辣椒（Capsicum annuum L.）在我國擁有較大的種植面積，其辛辣刺激的口味深受廣大消費(fèi)者喜愛，且其本身具有豐富的維生素C，因此具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。辣椒辣味程度的高低主要由辣椒素（Capsaicin）[（反式）8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺]含量的高低決定[1]，而辣椒素在醫(yī)療上被用于消炎、止痛以及治療肌肉酸痛等。目前已發(fā)現(xiàn)的辣椒素類物質(zhì)有20多種，其中占辣椒果實中總辣椒素類物質(zhì)含量的80%以上的主要成分是辣椒素（Capsaicin）和二氫辣椒素（Dihydrocapsaicin）[2]，超過50個基因家族參與了辣椒素類物質(zhì)的生物合成[3]。辣椒辣味的有無為質(zhì)量性狀，由顯性Pun1（最早用C表示）基因位點控制。該基因編碼辣椒酰基轉(zhuǎn)移酶（Acyltransferase，AT），亦即辣椒素合成酶（Capsaicin synthase，CS）[4]。辣椒辣味的強(qiáng)弱呈數(shù)量性狀特征，并受栽培環(huán)境等因素的影響[5]，目前已經(jīng)通過重組自交系構(gòu)建的物理圖譜得到了多個與辣椒素含量相關(guān)的基因位點[6]。辣椒辣味的強(qiáng)弱即辣椒素類物質(zhì)含量的多少，目前主要通過高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行檢

測[7]。基于辣椒素含量對辣椒品質(zhì)影響及辣椒產(chǎn)業(yè)對貴州省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要性，本研究主要對貴州省的主要的辣椒品種的辣椒素含量開展調(diào)查以及對合成辣椒素的關(guān)鍵基因Pun1基因進(jìn)行克隆，為今后通過分子育種手段提高辣椒品種中辣椒素含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗分別選取大方辣椒、辣豐8號、辛香15號、干椒3號、卓香908和花溪辣椒等線椒品種，成都8號、遵辣1號、遵辣6號、遵椒4號、單生理想、正椒12號、艷椒425、卓椒18號、朝陽1號、珠子椒等朝天椒品種共16個辣椒品種作為供試材料。

1.2 方法

1.2.1 辣椒素含量的測定

根據(jù)韓曉嵐等[8]的方法對供試?yán)苯菲贩N中的辣椒素和二氫辣椒素進(jìn)行提取，提取后的樣品通過過濾處理，使用高效液相色譜（HPLC）對其辣椒素類物質(zhì)進(jìn)行含量測定。

1.2.2 辣椒素含量控制關(guān)鍵基因Pun1的克隆

1.2.2.1取樣

通過辣椒素含量測定從16份供試材料中鑒定出高辣椒素含量和低辣椒素含量品種，并將其種植于遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗基地中，待開花后開始取樣。

1.2.2.2辣椒素合成酶Pun1基因克隆

以開花后25天的辣椒果實為材料提取總RNA，通過試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，依據(jù)NCBI中遵辣1號基因組中辣椒素合成酶基因（AT3基因）mRNA序列設(shè)計引物，Pun1F：ATGGCTTTTGCATTACCATC，Pun1R：TTAATTAGGCAATGAACTCAAGG。以cDNA鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：5 μL 10×buffer，6 μL dNTPs，0.5 μL Extaq DNA聚合酶，2 μL Pun1F，2 μL Pun1R（各25 pmol·μL-1），1 μL DNA模板鏈，加水至50 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min預(yù)變性，95 ℃?1 min，50 ℃ 50 s，72 ℃ 75 s，30個循環(huán)，最后72 ℃ 5 min延伸。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳回收后連接到pUC19載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選3個重組子檢測并送到華大基因公司測序。序列拼接采用DNAMAN8.0，序列比對采用Blast進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒素含量的測定

利用高效液相色譜法對16份辣椒品種進(jìn)行辣椒素含量測定，測定過程中加入遵辣1號的葉片、海南黃燈籠果實和SP163（甜椒品種）果實等3個對照，由表1可知，遵辣1號的葉片辣椒二氫素+辣椒素濃度最低，其次是SP163果實，最高的是海南黃燈籠果實。三個對照檢測的結(jié)果皆與實際辣味程度相符，故該方法適用于檢測辣椒素含量。在檢測的16個品種中，朝天椒類型品種果實中的二氫辣椒素+辣椒素濃度較線椒高，其中單生理想和正椒12號較高，分別達(dá)到3 323.11 ng·mL-1和3 160.52 ng·mL-1;線椒中干椒3號和卓香908較低，分別只有759.3 ng·mL-1和783.69 ng·mL-1。

2.2 辣椒素含量控制關(guān)鍵基因Pun1的克隆

根據(jù)上述辣椒品種辣椒素含量測定的結(jié)果，分別選取單生理想和辛香15號兩種辣椒素含量表現(xiàn)極端差異的辣椒品種作為克隆Pun1基因的供試材料。

2.2.1 辣椒果實總RNA的提取

本實驗使用QIAGEN公司生產(chǎn)的柱式RNA提取試劑盒分別提取單生理想和辛香15號辣椒果實總RNA。隨后用TAKARA公司的cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

2.2.2 基因全長cDNA序列獲得

參考已發(fā)布的遵辣1號辣椒基因組中的辣椒素合成相關(guān)基因Pun1基因（AT3基因）的兩個等位基因（AT3-D1和AT3-D2）序列信息，以此設(shè)計引物，以獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在兩個辣椒素含量表現(xiàn)極端差異的辣椒品種中均擴(kuò)增得到2個目標(biāo)條帶，其大小分別為1 400 bp和1 100 bp，利用DNAMAN軟件對兩個序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明兩條序列各自含有一段1 326 bp和1 017 bp的編碼區(qū)（見圖1）。

2.2.3 Pun1蛋白生物信息學(xué)分析

經(jīng)生物學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)AT3-D1和AT3-D2基因編碼的肽鏈長度分別為338和441個氨基酸，AT3-D1比AT3-D2在蛋白質(zhì)的N端少了100個氨基酸，但是在此后具有較高的同源性，一致性達(dá)到67.35%。用ExPASy ProtParam tool在線工具對上述兩個蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明其分子量分別為37.79 kD和49.68 kD，等電點（pI）分別為6.95和7.09，元素組成分別為C1677H2670N452O499S20和C2227H2484N590O655S21，不穩(wěn)定系數(shù)分別為32.28和39.34，均屬于穩(wěn)定蛋白。

利用在線工具TMHMM對AT3-D1和AT3-D2蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)在線分析發(fā)現(xiàn)，AT3-D1和AT3-D2蛋白不是一個跨膜蛋白。應(yīng)用SignalP 4.1在線軟件對AT3-D1和AT3-D2蛋白的信號肽進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白不存在信號肽，推測其為一個非分泌蛋白。

3 結(jié)論與討論

3.1 PUN1基因在辣椒素合成途徑中的重要作用

辣椒辣味的有無為質(zhì)量性狀，由顯性Pun1基因位點控制，該基因編碼辣椒?；D(zhuǎn)移酶，亦即辣椒素合成酶，在辣椒素合成酶（CS）催化作用下，香草基胺（苯丙氨酸途徑合成）和8-甲基-6-癸烯酰（支鏈脂肪酸途徑合成）縮合形成辣椒素，Pun1基因的突變導(dǎo)致辣椒辣味的丟失。因此，Pun1基因控制的辣椒素合成酶是整個辣椒素合成的最后一個步驟，也是一個限速步驟，該基因功能的發(fā)揮直接影響到辣椒素合成的數(shù)量和質(zhì)量，因此其在辣椒素合成途徑中發(fā)揮著重要作用。

3.2 Pun1基因在調(diào)控辣椒素含量差異上的具體作用機(jī)制

覃成等發(fā)現(xiàn)在沒有辣味或者辣度極低的辣椒中AT3-D1基因有長度不等的片段缺失，但是AT3-D2基因卻正常表達(dá)，并且這些辣椒果實中仍然存在痕量的辣椒素，這可能是由AT3-D2基因負(fù)責(zé)合成的，因此推測這兩個基因通過它們的協(xié)同作用合成并積累不同含量的辣椒素，進(jìn)而決定不同品種辣椒的辣度。本實驗中，在辣椒素含量高和含量低的辣椒品種中均克隆到AT3-D1和AT3-D2基因，證實了覃成等人的推測，但是AT3-D1中未發(fā)現(xiàn)有缺失的片段，該現(xiàn)象可能與本次所選的辣椒品種仍具有一定的辣度有關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步選擇甜椒品種加入實驗作為陰性對照，來驗證相關(guān)假說。辨明辣椒素合成的生物機(jī)制以及在整個合成機(jī)制中參與的重要基因及其生物功能是一個具有重要理論價值兼具重大應(yīng)用價值的課題。在諸多辣椒科研工作者的共同努力下，現(xiàn)已初步辨明其作用機(jī)制，但是由于其整個系統(tǒng)的復(fù)雜性，該項工作還將在今后很長的一段時期作為研究的重點。

參考文獻(xiàn)：

[1] Caterina M J，Schumacher M A.The Capsaicin Receptor：A Heat-activated Ion Channel in the Pain Pathway[J].Nature，1997，389（6653）：816-824.

[2] Bosland P W，Votava E J.Peppers：Vegetable and Spice Capsicums[J].Cabi Bookshop，2000（2）：14-39.

[3] Qin C，Yu C，Shen Y，et al.Whole-genome Sequencing of Cultivated and Wild Peppers Provides Insights into Capsicum Domestication and Specialization[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（14）：5135-5140.

[4] Blum E，Liu K，Mazourek M，et al.Molecular Mapping of the C Locus for Presence of Pungency in Capsicum[J].Genome，2002，45（4）：702-705.

[5] Blum E，Mazourek M，OConnell M A，et al.Molecular Mapping of Capsaicinoid Biosynthesis Genes and Quantitative Trait Loci Analysis for Capsaicinoid Content in Capsicum[J].Theoretical and Applied Genetics，2003，108（1）：79-86.

[6] Ben-Chaim A，Borovsky Y，F(xiàn)alise M，et al.QTL Analysis for Capsaicinoid Content in Capsicum[J].Theoretical and Applied Genetics，2006，113（8）：1481-1490.

[7] Collins M D，Wasmund L M，Bosland P W.Improved Method for Quantifying Capsaicinoids in Capsicum Using High-performance Liquid Chromatography[J].Hort Science，1995（30）：137-139.

[8] 韓曉嵐，胡云峰，趙學(xué)志，等.高效液相色譜法測定辣椒素及二氫辣椒素[J].中國食物與營養(yǎng)，2009（11）：43-46.

（責(zé)任編輯：趙中正）