郭雋馥 王 丹 叢培瑋 苗蘭英

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng)110847)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。盡管在過去的幾十年中胃癌的總體發(fā)病率有所下降，但在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率仍不可小覷，分別位居各種惡性腫瘤的第5位和第3位[1]。因此，尋找胃癌治療的有效藥物并探究其潛在的作用機(jī)制，具有重要的科學(xué)意義和廣泛的經(jīng)濟(jì)學(xué)效應(yīng)。最新的統(tǒng)計(jì)顯示，在非發(fā)達(dá)國(guó)家地區(qū)胃癌的死亡率居男性腫瘤患者之首[1]。我國(guó)是胃癌的高發(fā)國(guó)家，發(fā)病率及死亡率均高于世界平均水平。因此，深入研究胃癌發(fā)生進(jìn)展的分子機(jī)制，具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

近年來(lái)大量研究表明，中醫(yī)藥在延長(zhǎng)惡性腫瘤患者生存期、改善其生存質(zhì)量及預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[2-4]?！镀⑽刚摗分杏袝?“內(nèi)傷脾胃，百病由生”。這提示，脾胃功能狀態(tài)與各種疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)。若脾胃功能強(qiáng)健，正氣旺盛，則難罹疴疾；反之，脾胃虛弱，運(yùn)化失司，氣血無(wú)以生化，正氣逐漸降低，則易感受邪氣而發(fā)生胃癌[5]。陸喜榮等[6]的研究結(jié)果顯示，在胃癌的早期即可出現(xiàn)脾氣虛弱的癥狀，并且脾虛貫穿于胃癌進(jìn)展的各個(gè)階段?？梢姡鏆饨∑⒎勺鳛橹嗅t(yī)治療胃癌的常用療法。

四君子湯、補(bǔ)中益氣丸、參苓白術(shù)散，是健脾益氣的基礎(chǔ)方，具有“調(diào)補(bǔ)正氣，扶正固本，適應(yīng)原樣”的作用[7]。大量研究表明，四君子湯對(duì)肺癌、大腸癌、卵巢癌等均有療效[8-10]，并且具有安全、毒副作用少等特點(diǎn)。沈克平等[11]應(yīng)用胃腸安方(組方為四君子湯加減)對(duì)148例胃癌術(shù)后病例進(jìn)行隨機(jī)分組對(duì)照研究，結(jié)果顯示中藥組胃癌術(shù)后1、2、3年生存率明顯高于化療組，中藥組術(shù)后1年的轉(zhuǎn)移率亦呈最低，提示四君子湯加減的應(yīng)用可能對(duì)胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)具有抑制或延緩作用。本研究應(yīng)用益氣健脾方藥——四君子湯的含藥血清處理胃癌細(xì)胞，以期從影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的角度探討益氣健脾法治療胃癌的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 20只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重(280±20)g，購(gòu)于本溪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫18～23℃，相對(duì)濕度45%～55%，自由飲水進(jìn)食，經(jīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始實(shí)驗(yàn)。DMEM培養(yǎng)基和雙抗試劑均購(gòu)于Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)于依科賽公司；Trizol和Real-time PCR試劑盒均購(gòu)于TaKaRa公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板購(gòu)于康寧公司；Cell Counting Kit-8試劑和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；益氣健脾中藥四君子湯成分:人參、白術(shù)、茯苓、甘草購(gòu)于遼寧省中醫(yī)院門診藥局；人胃癌MGC803細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)。

1.2方法

1.2.1四君子湯含藥血清的制備 常規(guī)方法煎出四君子湯藥液200 ml，濃縮至100 ml，以10 ml/瓶分裝，高壓滅菌0.1～0.15 KPa、15 min，4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為2組:對(duì)照組10只，益氣健脾組 10 只。對(duì)照組每日灌胃給予生理鹽水1 ml/100 g，益氣健脾組每日灌胃給予四君子湯煎劑1 ml/100 g，1次/d，共7 d。第7天灌胃給藥1.5 h后腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h后，3 000 r/min 離心15 min分離血清，56℃水浴30 min 滅活,0.22 μm微孔濾膜過濾，-80℃冷凍保存。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇后的MGC803細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清和100 U/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，2～3 d細(xì)胞匯合率達(dá)80%后，常規(guī)胰酶消化傳代。

1.2.3CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組、15%對(duì)照血清組和15%益氣健脾血清組。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MGC803細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5×103～8×103個(gè)/孔，每組3個(gè)復(fù)孔。12～24 h后(匯合度達(dá)50%～70%)，更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)。饑餓6 h后空白對(duì)照組、15%對(duì)照血清組和15%益氣健脾血清組分別更換為含15%胎牛血清、含15%對(duì)照組血清以及含15%益氣健脾組血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在加藥處理24、48和72 h后，棄含藥培養(yǎng)基，PBS洗1次，每孔加入含10% CCK-8的DMEM完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組、15%對(duì)照血清組和15%益氣健脾血清組。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MGC803細(xì)胞，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2×105～3×105個(gè)/孔。12～24 h后(融合度達(dá)50%～70%)，更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)。饑餓6 h后空白對(duì)照組、15%對(duì)照血清組和15%益氣健脾血清組分別更換為含15%胎牛血清、含15%對(duì)照組血清以及含15%益氣健脾組血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在加藥處理72 h后，采用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，收集細(xì)胞。 PBS輕洗細(xì)胞1次，加入200 μl 1 × Binding Buffer重懸細(xì)胞，再向細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI，混勻后室溫避光孵育15 min。PBS輕洗細(xì)胞2次后送檢分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Real-time PCR檢測(cè)Caspase3和Bax mRNA表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組、15%對(duì)照血清組和15%益氣健脾血清組。加藥處理72 h后收集各組細(xì)胞，按Trizol試劑說(shuō)明書的方法提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參，Real-tine PCR檢測(cè)Caspase3和Bax mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s、60℃退火及延伸34 s、進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在AB I7500實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Caspase3引物序列:上游為5′-ATGACATCTCGGTCTGGT3′，下游為5′-AGAAACATCACGCATCAA-3′；Bax引物序列:上游為5′-CAGAGGCGGGGGATGATTG-3′，下游為5′-TGTCCAGCCCATGATGGTTC-3′；GAPDH序列[12]:上游為5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游為5′-GGAAGAT- GGTGATGGGATT-3′。

2 結(jié)果

2.1益氣健脾法對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞的增殖能力的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，與空白對(duì)照組及15%對(duì)照血清組相比較，15%益氣健脾血清組細(xì)胞的增殖能力在48 h和72 h均有明顯地下降趨勢(shì)(P<0.05)?？梢?，益氣健脾法能有效抑制人胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞的增殖能力。

2.2益氣健脾法對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞凋亡情況的影響 采用含15%益氣健脾組血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC80細(xì)胞72 h后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況(圖2)。各組凋亡率分別為:空白對(duì)照組(8.32±2.73)%，15%對(duì)照血清組(8.07±2.46)%，15%益氣健脾血清組(16.38±0.84)%。與空白對(duì)照組及15%對(duì)照血清組相比較，15%益氣健脾血清組細(xì)胞的凋亡率均顯著增加(P<0.01)。

圖1 加藥處理后MGC803細(xì)胞的增殖情況Fig.1 Proliferation of MGC803 cells 72 h after drug treatmentNote: *.P<0.05，48 h and 72 h 15% benefiting qi and strengthening spleen group vs control group or 15% control serum group.

圖2 加藥處理72 h后MGC803細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of MGC803 cells 72 h after drug treatment

圖3 加藥處理后各組MGC803細(xì)胞中Bax和Caspase3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression level of Bax and Caspase3 mRNA in MGC803 cells after drug treatmentNote: *.P<0.05,**.P<0.01，15% benefiting qi and strengthening spleen group vs control group or 15% control serum group.

2.3益氣健脾法對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞中Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)的影響 加藥處理72 h后，與空白對(duì)照組相比較，15%益氣健脾血清組MGC803細(xì)胞中Bax和Caspase3 mRNA含量均顯著下調(diào)(P<0.01)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Bax在15%益氣健脾血清組細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于15%對(duì)照血清組(P<0.01)，Caspase3在15%益氣健脾血清組細(xì)胞中的表達(dá)水平也低于15%對(duì)照血清組(P<0.05)。提示，益氣健脾法能有效抑制MGC803細(xì)胞中Bax和Caspase3基因的表達(dá)。

3 討論

中醫(yī)治療惡性腫瘤主要采用扶正解毒抗癌法。脾氣虛胃癌患者常伴有食欲不振、面色不華、苔薄、脈細(xì)、食后飽脹、倦怠乏力、便溏、泄瀉等癥狀。臨床上則常應(yīng)用益氣健脾方藥治療上述癥狀。四君子湯、參苓白術(shù)散、補(bǔ)中益氣湯是益氣健脾法的常用方藥。益氣健脾方藥的運(yùn)用，在改善癥狀、防止病情惡化、延長(zhǎng)患者的生存期、減輕放化療毒副作用方面收效顯著，明顯提高了患者的生存質(zhì)量[5]。

為了探究益氣健脾法治療胃癌的潛在作用機(jī)制，我們應(yīng)用益氣健脾法經(jīng)典方藥——四君子湯的含藥血清處理人胃癌MGC803細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及15%對(duì)照血清組相比較，15%益氣健脾組血清加入細(xì)胞48 h乃至72 h后，細(xì)胞的增殖能力均顯著下降。與此類似，徐云丹等[13]研究發(fā)現(xiàn)，采四君子湯含藥血清與5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)聯(lián)用能顯著抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)，且高劑量四君子湯血清與5-FU合用組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著高于5-FU單用組。此外，研究發(fā)現(xiàn)，四君子聯(lián)合小柴胡湯對(duì)肝郁脾虛型移植性原發(fā)性肝癌小鼠有明顯的抑瘤作用，其作用機(jī)制主要是誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[14]。課題組前期研究表明，采用四君子丸含藥血清處理人肺癌SPCA1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的凋亡率明顯增加，細(xì)胞中Caspase3/7/9 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)[8]。在本研究中，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和15%對(duì)照血清組相比較，15%益氣健脾血清組細(xì)胞的凋亡率均顯著增加。

然而，四君子湯如何影響胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其潛在的作用機(jī)制如何。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在各種死亡信號(hào)刺激后發(fā)生的一系列瀑布式的主動(dòng)性死亡過程，受多種基因調(diào)控。研究資料顯示，大部分的凋亡都與Caspase家族和Bcl2家族密切相關(guān)[15，16]。因此，我們選擇了Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者Caspase3以及Bcl-2家族中具有促進(jìn)凋亡作用的Bax作為檢測(cè)指標(biāo)以探究細(xì)胞是否已進(jìn)入了凋亡過程中的不可逆階段[17，18]。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及15%對(duì)照血清組相比較，15%益氣健脾血清組細(xì)胞中Caspase3和Bax mRNA的表達(dá)水平均顯著下調(diào)。此外，四君子湯抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的深層機(jī)制以及此方藥中各個(gè)成分的具體作用機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。

綜上所述，益氣健脾方藥四君子湯的含藥血清能夠有效抑制胃癌MGC803細(xì)胞的增殖能力并提高其凋亡率。此外，經(jīng)四君子湯含藥血清處理后細(xì)胞中凋亡促進(jìn)基因Bax和Caspase3的表達(dá)水平均明顯增加。提示，益氣健脾方藥可以有效抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，這可能是其治療胃癌的潛在機(jī)制。