洪纖纖，吳秀芹，羅金燕，王艷麗，孫國倉，安千里，邱 文，*，李 斌

(1.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058； 2.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103； 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

細(xì)菌性果斑病是當(dāng)前危害瓜類作物的重要?dú)缧詸z疫病害，其病原物為西瓜噬酸菌(Acidovoraxcitrulli，原Acidovoraxavenaesubsp.citrulli)[1]。自20世紀(jì)80年代開始，我國不斷有人發(fā)現(xiàn)并報(bào)道西瓜細(xì)菌性果斑病，后來研究表明其病原物為西瓜噬酸菌。瓜類細(xì)菌性果斑病屬于毀滅性的種傳病害，在西瓜苗期和成株期均可發(fā)病，幼苗期染病瓜苗的子葉首先出現(xiàn)水漬狀黃色小點(diǎn)并伴有暈圈，侵染植株真葉，受害初為水漬狀的小斑點(diǎn)，水漬狀病斑擴(kuò)大后因受粗葉脈的限制擴(kuò)展成暗色角斑或不規(guī)則壞死大斑；果實(shí)發(fā)育期首先在果皮上出現(xiàn)直徑幾毫米的水漬狀凹陷斑點(diǎn)，此后擴(kuò)展為圓形或不規(guī)則形，呈暗綠色斑塊，后逐漸擴(kuò)大匯集成片狀并逐漸深入果肉，最后引起全果腐爛[2]。

目前尚未見到寧?？h有西瓜果斑病害發(fā)生的報(bào)道，然而在2016年原農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物分布行政區(qū)名錄》中在浙江臺州與溫嶺出現(xiàn)瓜類果斑病菌。而甘薯莖腐病則是近年來在浙江19個(gè)縣市區(qū)甘薯上發(fā)生嚴(yán)重檢疫性細(xì)菌病害，引起極大重視[3]。據(jù)已有報(bào)道，田間常將甘薯與西瓜套種，該種植方式不僅能夠保證甘薯產(chǎn)量有所提高，又可增加一季西瓜收入，經(jīng)濟(jì)效益十分顯著[4-6]。但值得重視的是，本文在調(diào)查浙江寧海田間疑似甘薯莖腐病的過程中，對采集的病樣進(jìn)行病原物分離與純化，獲得4株煙草過敏反應(yīng)陽性的分離物，進(jìn)一步通過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色反應(yīng)、16S rRNA方法和致病性測定，將這些分離物鑒定為西瓜噬酸菌。

瓜類果斑病自然發(fā)病寄主范圍廣，包括西瓜、甜瓜、香瓜、黃瓜和南瓜等，但不能侵染馬鈴薯和甘薯[7]。作者通過致病性測定也發(fā)現(xiàn)這些分離物不能侵染甘薯，因此猜測可能是由于種子(苗)人為攜帶或者調(diào)運(yùn)過程導(dǎo)致當(dāng)?shù)靥镩g存在西瓜果斑病菌，因其未達(dá)到暴發(fā)的適宜外部環(huán)境，所以在當(dāng)?shù)厣形窗l(fā)現(xiàn)該病害；但與甘薯進(jìn)行套種后導(dǎo)致病原物從西瓜傳到非寄主植株甘薯上。本文詳細(xì)報(bào)道了浙江省甘薯上檢測到西瓜果斑病菌這一過程并結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際提出了針對性的防控和檢疫處理措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)病樣品及參考菌株

供試樣品為浙江省寧?？h田間采集的疑似甘薯莖腐的莖稈病樣標(biāo)本1；陽性對照菌株則是由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所植物細(xì)菌與檢疫實(shí)驗(yàn)室保存的西瓜果斑病菌AcidovoraxcitrulliSD01及甘薯莖腐病菌Dicekyadadantii1501。

1.1.2 供試植物

致病性測定采用市售西瓜種子(8424麒麟瓜)培育后帶1～2片子葉與真葉的西瓜苗，及在浙江金華采集的甘薯苗(浙773)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化

將甘薯病樣浸泡在70%乙醇中約30～60 s，進(jìn)行表面消毒，用無菌水清洗3遍，在病健交界處用滅菌剪刀剪取大小為5 mm2的組織，剪碎后于無菌水中靜置10～30 min，用接種環(huán)蘸取該組織液在NA培養(yǎng)基上劃線，長出單菌落后再一次劃線純化，用于后續(xù)致病性測定及病原物的鑒定實(shí)驗(yàn)[8]。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察

挑取單菌落于NA培養(yǎng)基平板上劃線，置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后，觀察其菌落大小、形狀、顏色、表面是否粗糙隆起、邊緣是否規(guī)則等培養(yǎng)性狀。

1.2.3 煙草過敏反應(yīng)

將分離獲得的14株菌株于30 ℃過夜培養(yǎng)，將其濃度統(tǒng)一調(diào)為108CFU·mL-1菌懸液，采用浸潤法將菌液接種到煙草葉片上，在30 ℃下培養(yǎng)24 h，調(diào)查過敏性反應(yīng)。

1.2.4 16S rRNA測定

將能引起煙草發(fā)生過敏反應(yīng)的4株菌株配制成108CFU·mL-1菌懸液，用該菌液為模板，采用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，由上海擎科生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：模板2 μL，上下游引物各2.5 μL，PCR Mix酶25 μL，無菌水18 μL。

PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性20 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延長10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。反應(yīng)終止后，以DL 2 000 marker為對照，PCR產(chǎn)物上樣于1%的預(yù)混有GelRed染料的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，結(jié)束后于凝膠成像儀上拍照保存，PCR產(chǎn)物送至上海擎科生物技術(shù)公司測序，并與Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行同源性對比。

1.2.5 特異性引物鑒定

特異性引物WFBl和WFB2來源于西瓜果斑病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA，所處位置分別為293～310和652～669 bp，引物之間的片段長度為360 bp[9]。目前，國內(nèi)外關(guān)于細(xì)菌性西瓜果斑病菌的PCR檢測主要還是基于16S rDNA設(shè)計(jì)的引物WFBl、WFB2[10-11]，引物核苷酸序列分別為WFB1(5′-GACCAGCCACACTCGGAC-3′)和WFB2(5′-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3′)，由上海擎科生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：模板1 μL，上下游引物各1 μL，PCR Mix酶10 μL，無菌水7 μL。

PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延長15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。

為了增強(qiáng)引物特異性，提高檢測鑒定準(zhǔn)確率，陳新塏[12]通過比較燕麥?zhǔn)伤峋鞴蟻喎N及其近緣種的ITS序列差異設(shè)計(jì)，篩選出了可用于燕麥?zhǔn)伤峋鞴蟻喎N檢測的特異引物TIF2和TIF3，該對引物正向起始于西瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulliAAC00-1)全基因組的1 579 467 bp處，反向止于1 579 928 bp處，所擴(kuò)增的片段為462 bp。引物核苷酸序列分別為TIF2(5′-GCTGGATCACCTCCTTTCTG-3′)及TIR3(5′-TGACGCAATCAAATTTTTGTCA-3′)，由上海擎科生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：模板1 μL，上下游引物各1 μL，PCR Mix酶10 μL，無菌水7 μL。

PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延長15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.6 致病性測定

采用浸潤法對健康的西瓜苗進(jìn)行致病性測定，將SD01標(biāo)準(zhǔn)菌株與待測菌30 ℃培養(yǎng)12 h后，配成108CFU·mL-1菌懸液，用針筒吸取1 mL菌液，將針頭拔出后采用浸潤法將菌液接種于長出子葉和真葉的西瓜苗葉柄上，并以實(shí)驗(yàn)室所保存西瓜果斑菌株SD01作為陽性對照，以水作為陰性對照。此外，同時(shí)采用浸泡法[13]對甘薯苗進(jìn)行致病性測定。把健康苗插入裝有培養(yǎng)菌液的三角瓶中，將經(jīng)過16 s初步篩選出的4株菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行過夜培養(yǎng)，配成108CFU·mL-1菌懸液，以無菌水作為陰性對照，接種后套袋保濕48 h(相對濕度90%～100%)，置溫度30 ℃，相對濕度80%的人工氣候箱中培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離

本實(shí)驗(yàn)共獲得14株病原菌株，編號為NH-01至NH-14，用于后續(xù)鑒定。

2.2 菌落形態(tài)和革蘭氏染色

在NA平板上，菌落初期為透明小斑點(diǎn)，生長較慢，菌落凸起，邊緣較整齊，后期菌落大小變化不大，革蘭氏染色陰性。

2.3 煙草過敏反應(yīng)

通過浸潤法注射煙草葉片，編號為NH-01、NH-02、NH-04、NH-05的4株菌株均出現(xiàn)明顯的煙草過敏反應(yīng)。

2.4 16S rRNA測定分析

將通過PCR擴(kuò)增獲得4個(gè)菌株的16S rRNA產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果顯示，以DL 2000 marker為參照，該核苷酸片段約在1 400 bp處有一明亮條帶，并無其他非特異性條帶(圖 2)，即獲得的目的DNA片段產(chǎn)量高，純度好，可進(jìn)行測序。將PCR產(chǎn)物送往上海擎科生物技術(shù)有限公司測序，測出的菌株16S rRNA基因序列大小約為1 390 bp，登錄Ezbiocloud網(wǎng)站，將菌株的16S rRNA序列與數(shù)據(jù)庫中親緣關(guān)系相近的已知序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明，分離得到的NH-01、NH-02、NH-04、NH-05四個(gè)菌株與已報(bào)道的AcidovoraxcitrulliDSM 17060(T)分別具有99.93%、100.00%、99.93%、99.93%的同源性，同時(shí)用MEGA(6.0)軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)分離得到的4個(gè)菌株屬于Acidovoraxcitrulli，確定了其系統(tǒng)發(fā)育地位。

圖1 細(xì)菌分離物在NA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Morphological characteristics of the bacterial isolates on NA

2.5 特異性引物鑒定

PCR結(jié)果顯示，本研究空白樣品無條帶，供試的其他菌株均擴(kuò)增到條帶，且大小與陽性對照菌株所擴(kuò)增的條帶一致(圖4目的條帶大小約360 bp。圖5目的條帶大小約462 bp)，表明了細(xì)菌性西瓜果斑病菌的存在。

2.6 致病性測定

結(jié)果顯示，陽性對照菌株SD01具有致病性(圖6-A、圖7-A)，供試菌株在西瓜子葉首先出現(xiàn)水漬狀黃色小點(diǎn)并伴有暈圈(圖6-B)，侵染西瓜真葉，受害初為水漬狀的小斑點(diǎn)，水漬狀病斑擴(kuò)大后成暗色角斑(圖7-C)，取病斑的病健交界處又分離到了該菌株，實(shí)驗(yàn)證明了這些分離物確實(shí)是瓜類果斑病菌。另一方面，甘薯莖腐病菌菌株編號1501浸泡處理48 h，甘薯莖稈明顯出現(xiàn)腐爛甚至斷開；蒸餾水處理莖稈末端長出新根，無致病性；而分離物NH-01、NH-02、NH-04和NH-05處理并未發(fā)現(xiàn)明顯癥狀，說明這些菌株對甘薯苗無致病性，甘薯為其非寄主植物(圖8)。

泳道M，DL 2 000 marker；泳道1，NH-01 16S rRNA擴(kuò)增條帶；泳道2，NH-02 16S rRNA擴(kuò)增條帶；泳道3，NH-04 16S rRNA擴(kuò)增條帶；泳道4，NH-05 16S rRNA擴(kuò)增條帶。Lane M， DL 2 000 marker; Lane 1， Gene band of NH-01 strain; Lane 2， Gene band of NH-02 strain; Lane 3， Gene band of NH-04 strain; Lane 4， Gene band of NH-05 strain.圖2 16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA PCR production

圖3 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位Fig.3 Phylogenetic status of the isolate strain

泳道M，DL 2 000 marker；泳道1，無菌蒸餾水(對照)；泳道2，Acidovorax citrulli SD01菌株擴(kuò)增條帶；泳道3，NH-01菌株擴(kuò)增條帶；泳道4，NH-02菌株擴(kuò)增條帶；泳道5，NH-04菌株擴(kuò)增條帶；泳道6，NH-05菌株擴(kuò)增條帶。Lane M， DL 2 000 marker; Lane 1， Negative control; Lane 2， Gene band of Acidovorax citrulli SD01 strain; Lane 3， Gene band of NH-01 strain; Lane 4， Gene band of NH-02 strain; Lane 5， Gene band of NH-04 strain; Lane 6， Gene band of NH-05 strain.圖4 特異性引物WFB1、WFB2擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of amplification products with specific primers WFB1， WFB2

泳道M，DL 2 000 marker；泳道1，無菌蒸餾水(對照)；泳道2，Acidovorax citrulli SD01菌株擴(kuò)增條帶；泳道3，NH-01菌株擴(kuò)增條帶；泳道4，NH-02菌株擴(kuò)增條帶；泳道5，NH-04菌株擴(kuò)增條帶；泳道6，NH-05菌株擴(kuò)增條帶。Lane M， DL 2 000 marker; Lane 1， Negative control; Lane 2， Gene band of Acidovorax citrulli SD01 strain; Lane 3， Gene band of NH-01 strain; Lane 4， Gene band of NH-02 strain; Lane 5， Gene band of NH-04 strain; Lane 6， Gene band of NH-05 strain.圖5 特異性引物TIF2、TIR3擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of amplification products with specific primers TIF2， TIR3

圖A，右子葉為SD01，Acidovorax citrulli SD01，作陽性對照；圖B，左子葉為雙蒸水，作為陰性對照；右子葉為所分離菌株。Picture A， The right leaf: SD01， Acidovorax citrulli SD01， as the positive control; Picture B， The left leaf， Double distilled water， as the negative control; The right leaf， The isolated strains.圖6 供試菌在西瓜子葉上的致病性測定Fig.6 Pathogenicity test for the subject strain on cotyledon of watermelon

圖A，SD01，Acidovorax citrulli SD01，作陽性對照；圖B，雙蒸水，作為陰性對照；圖C， 所分離菌株。Picture A， SD01， Acidovorax citrulli SD01， as the positive control; Picture B， Double distilled water， as the negative control; Picture C， The isolated strains.圖7 供試菌在西瓜真葉上的致病性測定Fig.7 Pathogenicity test for the subject strain on euphylla of watermelon

1501，Dicekya dadantii 1501，為陽性對照；DDW，雙蒸水，為陰性對照； NH-01， NH-02 ， NH-04， NH-05為所分離菌株。Treatments: 1501， Dicekya dadantii 1501， as the positive control；DDW， Double distilled water， as the negative control; NH-01， NH-02， NH-04， NH-05 were the isolated strains.圖8 不同處理下甘薯莖稈生長情況Fig.8 The growth of sweet potato stem under different treatments

3 討論

3.1 病原菌來源

從寧海縣疑似甘薯莖腐病樣品1(采集于2018年8月2日)中分離出14株菌株，通過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、致病性測定、煙草過敏反應(yīng)和16S rRNA序列分析，將其中4株菌株鑒定為西瓜果斑病菌，編號為NH-01、NH-02、NH-04、NH-05。首先，目前尚未見到寧?？h有西瓜果斑病害發(fā)生的報(bào)道，那么病原菌是從何而來？據(jù)原農(nóng)業(yè)部發(fā)布的植物檢疫病害最新名錄中顯示，浙江臺州與溫嶺已出現(xiàn)瓜類果斑病菌，因此猜測可能是由于種子(苗)帶菌通過人為攜帶或者調(diào)運(yùn)過程導(dǎo)致當(dāng)?shù)靥镩g存在西瓜果斑病菌，但又因其未達(dá)到暴發(fā)的適宜外部環(huán)境，所以在當(dāng)?shù)厣形窗l(fā)現(xiàn)瓜類細(xì)菌性果斑病害；此外，據(jù)已有報(bào)道[4-6]，將甘薯與西瓜套種既能保證甘薯產(chǎn)量有所提高，又可增加一季西瓜收入，從而達(dá)到雙收效益。通過實(shí)地調(diào)查，在采集地點(diǎn)附近存在西瓜與甘薯進(jìn)行套種現(xiàn)象，導(dǎo)致病原物從西瓜傳到非寄主植株甘薯上。但是關(guān)于寧海西瓜果斑病原菌的初侵染來自何處還有待進(jìn)一步研究。

3.2 防治措施

(1)加強(qiáng)檢疫措施。各級植物檢疫機(jī)構(gòu)應(yīng)嚴(yán)格采取產(chǎn)地檢疫、調(diào)運(yùn)檢疫、市場檢疫措施，加強(qiáng)瓜類作物育苗、生長期間監(jiān)測與調(diào)查，對曾發(fā)生瓜類果斑病害的田塊要加強(qiáng)跟蹤，對疑似癥狀進(jìn)行田間快速診斷。同時(shí)需在農(nóng)戶間普及瓜類果斑病的嚴(yán)重危害性和防控知識，增強(qiáng)農(nóng)戶檢疫意識，提高其防控水平。當(dāng)在田間發(fā)現(xiàn)有疑似癥狀的病株，立即拔除帶到田外深埋，并采樣送至植保站進(jìn)行檢測，及早確認(rèn)疫情，并采取封控措施。

(2)加強(qiáng)種子管理。瓜類果斑病作為一種毀滅性的種傳病害，應(yīng)該加強(qiáng)引種審批，一旦查見病害，應(yīng)及時(shí)指導(dǎo)生產(chǎn)者采取防控措施。首先要求瓜類作物的生產(chǎn)基地和種植大戶必須通過正規(guī)渠道購買經(jīng)檢疫合格的種子，同時(shí)通過干熱處理和藥劑處理可降低種子帶毒幾率，比如用40%福爾馬林150倍液浸種30 min后，用清水浸泡6～8 h，再催芽播種[14]。為了確保種子無攜帶病原物，應(yīng)進(jìn)行帶菌檢測。

(3)種植抗病品種。西甜瓜各品種間感病差異性較大。如甜瓜感病品種有皇后系列、86系列，抗病品種有西域系列等[7]。邢東光[14]研究表明，晚熟大型果花皮類西瓜慶發(fā)十二號較為抗病。因此，發(fā)病較重地區(qū)，可選用較抗病的西瓜品種減輕為害。

(4)做好農(nóng)業(yè)防治。首先應(yīng)在嫁接前用10%磷酸三鈉、75%乙醇或肥皂水對工具進(jìn)行消毒，防止人為交叉?zhèn)鞑?。其次是輪作換茬，應(yīng)在瓜類集中種植區(qū)實(shí)行3年以上的輪作。再次是加強(qiáng)田間管理，做到合理密植，適量灌溉與施肥，防止病害傳播。

(5)做好化學(xué)防治。使用溴甲烷進(jìn)行土壤消毒處理，密封熏蒸后通風(fēng)2～3 d揭膜后再進(jìn)行播種或移栽。已經(jīng)發(fā)病的大棚或露地田塊可撒施石灰氮、生石灰或硝石灰，也可選用銅制劑或抗生素等藥劑進(jìn)行預(yù)防，如可殺得、噻菌銅等銅制劑，農(nóng)用鏈霉素、四環(huán)素等抗生素[15]能夠快速有效地殺死田間病原細(xì)菌。

瓜類果斑病是全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性病害，浙江臺州與溫嶺已出現(xiàn)瓜類果斑病菌，本文在浙江寧海甘薯上檢出瓜類果斑病菌，顯示隨著農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易的日益頻繁，病害隨瓜類作物種子(苗)調(diào)運(yùn)傳入浙江省其他市縣的風(fēng)險(xiǎn)正在加大。