徐杰偉，陳美玲，廖黎黎，黃永漢

（佛山市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東佛山528000）

透明質(zhì)酸是一種高分子量的黏多糖（糖胺聚糖），也是卵母細(xì)胞透明帶基質(zhì)的主要成分［1］。成熟的精子頭部表面有透明質(zhì)酸的受體，容易與卵細(xì)胞結(jié)合。精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率可反映精子的成熟度。精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)試劑盒作為二類體外診斷試劑，目前正在做臨床試驗(yàn)評價(jià)其檢測性能，且國內(nèi)尚無同類產(chǎn)品正式上市。佛山市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心是精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)試劑盒臨床評價(jià)試驗(yàn)點(diǎn)之一。本研究通過分析精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果與精液常規(guī)、精子DNA碎片率等指標(biāo)間的相關(guān)性，探討其評價(jià)精液質(zhì)量的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2018年4月至7月在佛山市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心男科門診就診的男性患者549人，年齡19～52歲，平均31.6歲?；颊哌x擇標(biāo)準(zhǔn)：①成年男性，年齡18～60歲；②精液常規(guī)檢查精子濃度≥20×106/mL，前向運(yùn)動精子率（PR）≥10%；③標(biāo)本的留取方式為手淫法或用特制的精液采集套采集。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未禁欲_2～7 d的患者；②經(jīng)精液常規(guī)檢測判斷為無精子癥患者；③精液總量＜1.0 mL的標(biāo)本；④因收集或保存不當(dāng)不能用于檢測的標(biāo)本；⑤ 精子運(yùn)動力過低者（PR＜10%）；⑥以性交方式留取標(biāo)本的患者。所有研究對象均簽署知情同意書，并得到我院倫理委員會同意。

1.2 精液標(biāo)本采集及常規(guī)分析

所有研究對象均禁欲2～7 d，在生殖醫(yī)學(xué)中心取精室內(nèi)通過手淫法采集精液標(biāo)本于無菌取精杯中，經(jīng)電子天平稱量精液體積，放置于37℃恒溫板，待精液完全液化后，按《WHO人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊（第五版）》標(biāo)準(zhǔn)［2］，用計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀（美國HAMILTON THORNE IVOS，CASA）檢測精子相關(guān)參數(shù)；用精密pH值試紙測定精液pH；用深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供的巴氏染色液進(jìn)行精液涂片染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析。

1.3 精子DNA完整性檢測

采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)（sperm chromatin dispersion test，SCD）檢測精子DNA的完整性，試劑盒由深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供，檢測過程嚴(yán)格按說明書操作。在普通顯微鏡高倍視野下，觀察400個染色的精子，按判斷標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算精子DNA的完整率。精子DNA碎片率（%）=1-DNA完整率，表示精子DNA損傷程度。

1.4 精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)

①在包被載玻片的“T”孔（測定孔）內(nèi)加入液化的精液10μL，置于20～30℃的室溫或恒溫平臺至少反應(yīng)10 min，但不要超過20 min。②普通光學(xué)顯微鏡或相差顯微鏡40倍物鏡下觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)“T”孔內(nèi)500個活動精子，記錄精子尾部持續(xù)鞭打但頭部被結(jié)合在玻片表面難以自由前行的精子數(shù)量（成熟精子），不被結(jié)合的精子則呈現(xiàn)活動力不受限的自由運(yùn)動狀態(tài)。精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率（%）=（被結(jié)合精子數(shù)÷計(jì)數(shù)活動精子總數(shù)）×100%。試劑盒給定的正常參考值為≥58.5%［3］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)分析精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)檢測結(jié)果

549例患者精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率測定范圍為9%～89%，平均56.5%。其中275例結(jié)合率＜58.5%設(shè)為研究組，平均年齡（31.8±5.6）歲；274例結(jié)合率≥58.5%設(shè)為正常對照組，平均年齡（31.4±5.1）歲。

2.2 兩組間精液常規(guī)參數(shù)、精子DNA碎片率比較

結(jié)果見表1。對照組的精子質(zhì)量要優(yōu)于研究組。兩組間精液pH、精子濃度、前向運(yùn)動百分比、頭部缺陷率、殘留胞質(zhì)、活動率、正常形態(tài)率的比較有顯著性差異（P＜0.05）；但精液體積、精子DNA碎片率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組精液常規(guī)參數(shù)、精子DNA碎片率比較

2.3 精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率與其他指標(biāo)的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率與精子濃度（r=0.230，P=0.000），活動率（r=0.254，P=0.000），正常形態(tài)率（r=0.261，P=0.006），前向運(yùn)動百分比（r=0.245，P=0.000）呈正相關(guān)；與頭部缺陷率（r=-0.248，P=0.009），殘留胞質(zhì)（r=-0.219，P=0.022），精液 pH（r=-0.145，P=0.001）呈負(fù)相關(guān)；與精子DNA碎片率無明顯相關(guān)性（r=0.010，P=0.864）。

3 討論

精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)作為一項(xiàng)新的評價(jià)精子成熟度的實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)逐漸在臨床得到開展。成熟精子容易與卵細(xì)胞透明帶結(jié)合，實(shí)現(xiàn)穿透與受精；不成熟的精子不具備與透明質(zhì)酸結(jié)合的能力，預(yù)示著精子成熟障礙［3］。本研究測定了549例患者的精液標(biāo)本，結(jié)果顯示精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)具有良好的測定區(qū)間，其測定范圍是9%～89%。本組資料結(jié)果也顯示精子濃度、活動率、正常形態(tài)率、頭部缺陷率和殘留胞質(zhì)等指標(biāo)對照組均優(yōu)于研究組，而精液體積、精子DNA碎片率間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析結(jié)果顯示精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率與精子濃度、前向運(yùn)動百分比、活動率、正常形態(tài)率等指標(biāo)間呈正相關(guān)；與精液pH、頭部缺陷率、殘留胞質(zhì)等指標(biāo)間呈負(fù)相關(guān)；而與精子DNA碎片率無顯著相關(guān)性。

Huang等［4］研究發(fā)現(xiàn)，精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)選出的精子與胚胎學(xué)家根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)在顯微鏡下挑選出的精子的DNA完整性無顯著的差異；Cohen-Bacrie等［5］測定1 600多例標(biāo)本的研究結(jié)果顯示，精子DNA損傷與快速前向運(yùn)動、精子存活率無相關(guān)性；上述研究提示活動精子與DNA完整性間無顯著性相關(guān)性，這與本研究的相關(guān)結(jié)果基本一致。

Nijs等［6］報(bào)道精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率與精子的形態(tài)、濃度和活力無關(guān)；劉瑜等［7］報(bào)道精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率與核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率、精子DNA碎片率指標(biāo)間存在較弱的負(fù)相關(guān)性，核蛋白組型轉(zhuǎn)換率與精子DNA碎片率間呈正相關(guān)；亦有研究［8-9］認(rèn)為成熟障礙的精子DNA碎片率高。這些研究均與本研究結(jié)果不一致，可能與精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)檢測的只是精液中的活動精子或研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。

Worrilow等的研究［10］表明，并非所有的活動精子都能結(jié)合透明質(zhì)酸，與透明質(zhì)酸結(jié)合的精子有著較為完整的DNA和染色體，精子質(zhì)量好；相比于不能與透明質(zhì)酸結(jié)合的精子，能與透明質(zhì)酸結(jié)合的精子生育功能更強(qiáng)。Liu等［11-12］研究表明，受精失敗多數(shù)是因?yàn)榫尤毕輰?dǎo)致精子不能結(jié)合和穿透卵細(xì)胞透明帶引起。

綜上，精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)敏感性好，能反映精子功能，精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率與精液質(zhì)量具有良好的相關(guān)性，可以作為臨床評價(jià)男性生育力的指標(biāo)之一。