高戈，張云山

體外受精-胚胎移植（in-vitro fertilizationembryotransfer，IVF-ET）技術開展40年至今，已成為臨床治療不孕癥最為有效的手段，但其胚胎著床率僅為20%～30%[1]。自1978年首例試管嬰兒出生以來，低種植率始終是生殖醫(yī)學領域尚未解決的問題之一，也是限制人類輔助生殖技術發(fā)展的瓶頸，而且反復植入失敗更會對患者及家庭造成沉重的經濟負擔和精神壓力，同時增加臨床醫(yī)生的工作負荷。目前，世界范圍內，為減少多胎妊娠，選擇性單胚胎移植正逐漸取代多胚胎移植成為一種趨勢，因此提高種植率的意義顯得尤為重要?，F結合近年來國內外相關研究成果對影響胚胎種植率的關鍵因素進行綜述。

1 胚胎質量

胚胎本身的質量無疑是影響胚胎種植率的關鍵因素之一，如何從眾多胚胎中挑選出最具發(fā)育潛能的胚胎用于移植是IVF實驗室的胚胎學家們一直以來最為關心的問題。目前世界上絕大多數IVF實驗室采用的仍然是“試管嬰兒之父”Robert Edwards教授于1970年提出的傳統(tǒng)的形態(tài)學評估的方法，從細胞數量、碎片率以及均一性等方面來評價胚胎[2]。隨著研究的深入和技術的發(fā)展，胚胎學家們認識到傳統(tǒng)的形態(tài)學評估由于只是在固定的幾個時間點對胚胎進行觀察，因此并不能完全反映胚胎發(fā)育潛能的真實情況，一些用于挑選優(yōu)質胚胎的新技術和新方法可能更為有效。

1.1 縮時攝影（Time-lapse）技術 Time-lapse技術即每隔一段固定時間（如5 min或者10 min）對胚胎進行一次拍照，然后將拍攝的照片按時間順序制作成影片，以此來反映胚胎的動態(tài)發(fā)育過程。1997年，Payne等[3]首次運用該技術對胞漿內單精子注射（ICSI）授精后的胚胎發(fā)育進行觀測，結果表明不同卵母細胞極體出現、原核形成及消失的時間明顯不同，在優(yōu)劣胚胎中有顯著差異。

Time-lapse技術較傳統(tǒng)的形態(tài)學評估的優(yōu)勢是不需要將胚胎拿出培養(yǎng)箱，一定程度上避免了溫度、pH值、CO2濃度等突然發(fā)生變化對胚胎發(fā)育的影響，同時可以結合不同指標（如雙極體出現的時間，原核出現及消失時間，胚胎發(fā)育到2細胞、3細胞、4細胞、5細胞階段分別的用時，囊胚腔出現時間，囊胚開始擴張及孵出時間等）對胚胎發(fā)育進行動態(tài)形態(tài)學評估[4]。同時這項技術也屬于非侵入性操作，不需對胚胎進行活檢。

目前Time-lapse技術同樣存在一些問題，首先由于拍照而造成的光暴露對胚胎發(fā)育是否存在負面影響仍無定論；其次，其造價高昂且在分析時相比傳統(tǒng)形態(tài)學評估更加耗時；再次，其動態(tài)評估參數并沒有統(tǒng)一標準，且對其實際效果是否優(yōu)于傳統(tǒng)形態(tài)學評估仍存爭議[5-8]。

1.2 植入前遺傳學篩查（preimplantation genetic screening，PGS） 高齡、反復流產、反復植入失敗、嚴重男性因素不孕患者因為染色體非整倍體發(fā)生率增高，學術界提倡對這部分人群進行PGS，目的是篩查23對染色體非整倍體，將更具發(fā)育潛能的整倍體胚胎用于移植，降低流產風險，提高活產率[9-11]。其原理是在胚胎發(fā)育到第3天時對胚胎進行激光打孔，然后在第5天或者第6天時取從激光打孔處孵出的少量外滋養(yǎng)層細胞進行活檢，活檢方法從過去的熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）到后來的微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCGH），再到目前主流的高通量測序（next generation sequencing，NGS）[12-13]。

2015年，一些IVF中心報道不經選擇對所有IVF患者進行PGS顯著提高了妊娠率[14]。有研究顯示，經PGS篩查后的高齡（≥38歲）女性胚胎種植率、活產率與不經PGS篩查的對照組相比顯著提高，流產率明顯降低[15]。PGS結合囊胚移植可顯著提高妊娠率、持續(xù)妊娠率、活產率，降低流產率和多胎風險，在高齡和反復流產的患者中具有較好的臨床效果[16-18]。隨著NGS技術的發(fā)展，特別是其成本的大幅度下降，其在PGS中的大范圍應用取得了令人滿意的效果[19-21]。近年來，一些學者更是致力于無創(chuàng)PGS的研究，如通過對胚胎培養(yǎng)液中游離DNA進行檢測取代胚胎活檢，盡管取得了一些成果[22-23]，但其敏感度和特異度仍有待提高，且距臨床大范圍推廣仍存較大差距。

PGS技術目前仍存在一些頗具爭議的問題，首先，目前世界上絕大部分IVF實驗室采用的活檢方法仍屬于有創(chuàng)操作，可能帶來胚胎損傷、植入潛能下降、表觀遺傳變化及成年后可能的遠期影響，目前尚缺乏充分的研究數據證明其遠期的安全性；其次，PGS仍然無法預知嵌合體胚胎的結局，隨著NGS在PGS中的應用，嵌合體胚胎的診斷率提高，但對于嵌合體胚胎是否可以移植的問題尚無定論；再次，PGS并不能改善可用胚胎質量，也不能增加可移植胚胎數量，同時增加了患者的經濟成本，因此是否應該擴大其適用范圍，不加選擇地對所有IVF患者進行PGS目前仍存在較大爭議[24]。

2 子宮內膜容受性（endometrial receptivity）

近年研究表明，子宮內膜容受性是除胚胎質量外的另一影響胚胎種植率的決定性因素。2006年有學者研究發(fā)現，60%的胚胎種植失敗應歸咎于不合適的子宮內膜容受性[1]。2015年Galliano等[25]的研究再次證實，至少有25%的患者的子宮內膜種植窗口期（window of implantation，WOI）會提前、延后或比通常的窗口期更短。因此根據個體化的WOI進行移植，特別是對那些反復植入失敗的患者來說顯得十分必要?；诖?，科學家們一直致力于尋求一種簡便且能夠精準預測WOI的方法。

1950年，Noyes等[26]描述了排卵后子宮內膜的時相變化，關于子宮內膜活檢組織學分期的這一研究在當時被認為是評估子宮內膜分化和成熟程度的“金標準”，但隨后的研究發(fā)現，此項技術在評估子宮內膜容受性方面具有一定的局限性，并不準確；“胞飲突”也曾被認為是在窗口期子宮內膜發(fā)生形態(tài)學改變的最佳標志物，但隨著研究的深入，越來越多的學者對“胞飲突”提出質疑，認為“胞飲突”在黃體期持續(xù)時間超過5 d，不能準確描繪WOI[27]。

近期研究顯示，有多個基因在子宮內膜各個時期的表達譜有明顯差異[28]，例如編碼外周血雌孕激素、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、黏蛋白1（mucoprotein-1，MUC-1）、細胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAMs）、肝素結合性表皮生長因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）的基因，這些基因被認為是檢測子宮內膜容受性潛在的生物學標記物；不僅如此，一些研究離子通道的科學家還發(fā)現，WOI的出現與囊性纖維化跨膜通道調節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）、 上 皮 細 胞 鈉 通 道（epithelial sodium channel，ENaC)、電壓依賴性鈣通道（voltage dependent calciumchannel，VDCC）以及瞬時受體電位通道（transient receptor potential channel，TRP）等多種離子通道有關[29]。

來自西班牙瓦倫西亞大學生殖醫(yī)學研究院的研究團隊通過比較子宮內膜自然狀態(tài)與超排卵的基因表達譜發(fā)現，超促排卵技術對WOI有影響，造成移植成功率降低[30]。他們通過對比自然狀態(tài)子宮內膜不同時期基因表達譜，將238個可能與子宮內膜容受性相關的基因制作成基因芯片，通過相關臨床試驗證實子宮內膜容受性芯片（endometrial receptivity array，ERA）的準確性要優(yōu)于傳統(tǒng)組織學活檢[31-34]。有學者通過一種間接的免疫熒光法來測定核仁管系統(tǒng)（nucleolar channel system，NCS）預測WOI，其結果與ERA的準確性相當[35]。上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院的研究團隊采用二代測序技術，對自然周期女性黃體生成激素（LH）峰值后第2天（LH+2）和第7天（LH+7）的子宮內膜組織進行了轉錄組測序 的 比 較 ， 證 實 GLI2、CDC25A、TLR9、MT1G 和SLC5A1等基因與子宮內膜容受性有關[36]。

盡管各項對子宮內膜容受性和種植窗口期的研究取得了一定成果，但目前仍存在一些問題。首先，目前絕大多數針對子宮內膜容受性的研究集中于內膜組織本身，因此，如想在ET前對WOI進行預測就需要提取內膜組織，這種有創(chuàng)操作可能會對后續(xù)胚胎著床造成負面影響。其次，目前針對子宮內膜容受性的研究方法集中于轉錄組學，特別是基因芯片技術，盡管高通量、自動化基因芯片技術已經比較成熟，使生物學標記物的篩選及鑒定有了重大突破，但基因的表達水平與活性蛋白質的量之間并不是簡單的線性關系，從基因轉錄到翻譯再到蛋白質最終執(zhí)行功能受到多級水平的調控。因此，未來對于WOI生物學標記物的研究如果從子宮內膜組織轉向血清、從轉錄組轉向蛋白質組可能會取得更重要的突破。

3 結語

IVF-ET經過40年的發(fā)展，衍生出如ICSI、PGS、Time-lapse、ERA等新的技術手段，隨著這些新技術在胚胎挑選以及個體化ET中的應用，胚胎種植率以及IVF-ET的成功率將不斷提高。同時，伴隨干細胞治療在子宮內膜修復和治療卵巢功能早衰中的成功應用[37-38]，以及為治療線粒體遺傳疾病而誕生的“三親”試管嬰兒技術，IVF-ET的治療范圍將進一步擴大。盡管基因編輯技術在人類生殖細胞中的應用引發(fā)了巨大爭議，但不可否認，隨著CRISPR-Cas9[39]等基因編輯技術的出現，未來人們對IVF-ET的期望也將逐漸從“能生”轉變?yōu)椤皟?yōu)生”，盡管在技術層面以及醫(yī)學倫理問題上還將有相當長的一段路要走，但隨著科學技術的不斷發(fā)展，IVF-ET必將迎來更大發(fā)展。