副豬嗜血桿菌及巴氏桿菌雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立

姜睿姣，周麗軍，鄔旭龍，張鵬飛，羅梓丹，肖 璐，王 印,2，姚學(xué)萍,2，楊澤曉,2，羅 燕,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130)

副豬嗜血桿菌病又名革拉澤氏病(Gl覿sser's disease)，由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，Hps)引起。它是豬上呼吸道的一種共棲菌[1-2]，在豬抵抗力較低的情況下侵入體內(nèi)。常引起豬的漿液性或纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、高熱、呼吸道紊亂等癥狀，嚴(yán)重時致死。豬巴氏桿菌病(Swine pasteurellosis)又稱豬肺疫，俗稱“鎖喉風(fēng)”或“腫脖子瘟”，是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)引起的重要傳染病，該菌也常定居于豬的上呼吸道中，體溫失調(diào)、抵抗力降低、生長環(huán)境惡劣、極端天氣是該病的主要誘因。嚴(yán)重時豬出現(xiàn)犬坐姿勢張口呼吸，引起肺炎、呼吸困難。

兩種細(xì)菌均能夠引起豬的發(fā)熱、呼吸困難、咳嗽、關(guān)節(jié)腫脹，主要能致豬肺部產(chǎn)生出血以及纖維素滲出物等相似的病理變化。近幾年，該兩種疾病已經(jīng)對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]，雖然有分別檢測該兩種疾病的常規(guī)PCR 方法[5-6]，但在實(shí)際應(yīng)用中其存在著操作繁瑣、耗時較長等問題。因此，高效、快速、準(zhǔn)確的檢測方法能夠?yàn)楹罄m(xù)的治療及防控節(jié)約更多的時間，最大程度地減小經(jīng)濟(jì)損失。

熒光定量PCR (qPCR)依靠它靈敏性高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時間短等諸多優(yōu)點(diǎn)在疾病檢測早期具有極大的優(yōu)勢[7-8]。此外，其還具有操作簡單、結(jié)果觀察方便等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崟r反映PCR 擴(kuò)增進(jìn)程，無需對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物再處理[9]。雙重及多重?zé)晒舛縋CR是在熒光定量PCR 上發(fā)展起來的，它在同一時間、同一體系內(nèi)，能夠根據(jù)不同需求擴(kuò)增不同數(shù)目的靶標(biāo)，更大程度地提高了擴(kuò)增的效率，縮短了檢測時間。

目前，多重?zé)晒舛縋CR 已經(jīng)應(yīng)用于多種疾病的檢測：林碧蓮等通過多重?zé)晒舛縋CR 快速檢測嬰幼兒奶粉中的沙門氏菌、克羅諾桿菌和金黃色葡萄球菌[10]；Hu 建立了同時檢測8 種食源性致病菌的多重?zé)晒舛縋CR 方法[11]；Park 等建立了魚類和水產(chǎn)品中5 種弧菌的多重?zé)晒舛縋CR 檢測方法[12]；何世成等建立了同時檢測豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2 型的多重?zé)晒舛縋CR 方法[13]。本研究擬建立一種同時檢測Hps 和Pm 的雙重?zé)晒舛縋CR 方法，為臨床快速、準(zhǔn)確排查疫情提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 Hps、Pm、胸膜肺炎放線桿菌、豬沙門氏菌、豬鏈球菌、豬丹毒絲菌、大腸桿菌、疑似感染Hps 的15 份病死豬肺組織、疑似感染Pm 的10 份病死豬肺組織、3 份人工混合感染Hps、Pm 的豬肺組織及胸腔積液均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供。DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技有限公司；pMD19-T 載體、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Marker 購自寶生物工程(大連)有限公司；SsoAdvanced Universal Probe Supermix 購自Biorad 公司。

1.2 引物及TaqMan 探針的設(shè)計與合成 參考GenBank 中已登錄的 Hps (FJ416469.1)及 Pm(EF219454.1)的基因序列，選取Hps 的OmpP2基因、Pm 的PlpE基因作為檢測靶序列，利用軟件Primer Premier 5 設(shè)計兩對特異性引物及TaqMan 探針(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物及TaqMan 探針序列信息Table 1 Sequences of oligonucleotides primers and TaqMan probes

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 將Hps 涂布于含10 %胎牛血清、1 μL/mL NAD+的TSA 中，37 ℃培養(yǎng)24 h；Pm 涂布于含5 %胎牛血清、1 μL/mL NAD+的TSA 中，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單個菌落連續(xù)純化3 次。用生理鹽水洗脫純培養(yǎng)物，提取菌株DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用特異性引物OmpP2-F/OmpP2-R 和PlpE-F/PlpE-R 分別PCR 擴(kuò)增兩種菌的目的基因，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段，克隆至pMD19-T 載體，陽性克隆由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定，構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為Hps-CZ、Pm-CZ。利用Nano Drop 2000 核酸蛋白分析儀測定兩種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，并計算其拷貝數(shù)[14]。

1.4 單一熒光定量PCR 方法的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以Hps-CZ 和Pm-CZ 為模板，采用各自的引物與探針(OmpP2-F/OmpP2-R/OmpP2-P 和PlpE-F/PlpE-R/PlpE-P)，分別進(jìn)行兩種菌的單一熒光定量PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系均為20 μL，依次對引物濃度(0.1 μmol/L ～1.0 μmol/L)、TaqMan 探針濃度(0.2 μmol/L～1.0 μmol/L)、退火溫度(56 ℃～62 ℃)進(jìn)行優(yōu)化。按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件，將兩種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至102拷貝/μL～108拷貝/μL 并作為模板，分別進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。以循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)、模板稀釋度為橫坐標(biāo)，建立單一熒光定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 雙重?zé)晒舛縋CR 的優(yōu)化及建立 以構(gòu)建的單一熒光定量PCR 方法為基礎(chǔ)，取各組分最優(yōu)濃度為參照標(biāo)準(zhǔn)，按照矩陣試驗(yàn)確定最佳雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)條件。反應(yīng)體系為20 μL：2×SsoAdvanced Universal Probe Supermix 10 μL，優(yōu)化上、下游引物濃度(0.4 μmol/L～0.8 μmol/L)、TaqMan 探針濃度(0.5 μmol/L～1.0 μmol/L)，模板各2 μL，ddH2O 補(bǔ)足20 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃10 s，在56 ℃～62 ℃優(yōu)化退火溫度時間并設(shè)置為30 s，40 個循環(huán)，延伸時采集熒光信號。

1.6 雙重?zé)晒舛縋CR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將兩種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至103拷貝/μL～108拷貝/μL，相同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以相同體積混合作為模板，利用本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增，以循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)、模板稀釋度為橫坐標(biāo)，建立雙重?zé)晒舛縋CR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn) 提取本實(shí)驗(yàn)室保存的胸膜肺炎放線桿菌、沙門氏菌、豬鏈球菌、豬丹毒絲菌、大腸桿菌、Hps、Pm 基因組DNA 并作為模板，同時以兩種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，以ddH2O 作為陽性對照，采用本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，以評估該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 將兩種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別10 倍倍比稀釋至101拷貝/μL～108拷貝/μL 并分別以其為模板，按照本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法擴(kuò)增。同時將上述各稀釋度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板采用各菌株的單一熒光定量PCR 及常規(guī)PCR[5]分別進(jìn)行擴(kuò)增，將各檢測結(jié)果比較分析，以確定該方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取濃度為103拷貝/μL～107拷貝/μL 的兩種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3 次；取上述重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在3 個不同的時間采用該方法，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。計算每一次反應(yīng)的Ct 值(或Cq 值)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)，以此評估所建立方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測 取實(shí)驗(yàn)室保存的28 份疑似感染組織樣品、3 份人工混合感染樣品，提取細(xì)菌基因組后作為模板，分別用建立的雙重?zé)晒舛縋CR法、常規(guī)PCR 法、細(xì)菌分離鑒定檢測，以此驗(yàn)證建立方法的可行性與可靠性。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 采用特異性引物PCR 擴(kuò)增Hps 的OmpP2基因、Pm 的PlpE基因。結(jié)果顯示，Hps 和Pm 經(jīng)擴(kuò)增分別得到約150 bp 和約140 bp 的目的條帶(圖1)。將PCR 產(chǎn)物回收純化后，分別克隆至pMD19-T 載體構(gòu)建兩株菌的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品Hps-CZ、Pm-CZ，經(jīng)測序鑒定未發(fā)現(xiàn)OmpP2、PlpE基因突變，結(jié)果與預(yù)期相符。表明正確構(gòu)建了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品Hps-CZ、Pm-CZ，經(jīng)計算，兩種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別為5.60×1010拷貝/μL、7.58×1010拷貝/μL。

圖1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of standard plasmids by PCR

2.2 兩株菌單一熒光定量PCR 方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 經(jīng)優(yōu)化后，建立了Hps、Pm 單一熒光定量PCR 方法。體系為20 μL，Hps 和Pm 上下游引物各0.8 μL (0.4 μmol/L)、1.2 μL (0.6 μmol/L)，TaqMan探針均為1.2 μL(0.6 μmol/L)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各1.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃5 min，95 ℃10 s，退火溫度分別為58 ℃、62 ℃30 s，共39 個循環(huán)。Hps 標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.342X+38.975，E=99.2 %，R2=0.999；Pm 標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.141X+37.636，E=108.2 %，R2=0.998，結(jié)果表明兩種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在102拷貝/μL～108拷貝/μL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3 雙重?zé)晒舛縋CR 方法的建立 通過矩陣試驗(yàn)最終確定了雙重?zé)晒舛縋CR 方法的最佳反應(yīng)條件。在20 μL 反應(yīng)體系中，Hps 上下游引物各1.2 μL(0.6 μmol/L)，Pm 上下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，TaqMan 探針分別為Hps 0.8 μL (0.4 μmol/L)、Pm 1.0 μL(0.5 μmol/L)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各1.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 補(bǔ)足20 μL，擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min；95 ℃10 s，58 ℃30 s，共39 個循環(huán)。

2.4 雙重?zé)晒舛縋CR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取103拷貝/μL～108拷貝/μL 6 個濃度梯度的等體積混合重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Hps 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.371X+39.258，擴(kuò)增效率為98.0 %。Pm 的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.999，標(biāo)曲方程為Y=-3.284X+37.988，擴(kuò)增效率為101.6 % (圖2)。表明：兩種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物在上述濃度范圍內(nèi)，與Ct 值具有良好的線性關(guān)系。

圖2 雙重?zé)晒舛縋CR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(--：Hps；——：Pm，下同)Fig.2 Standard curve of the duplex qPCR(--: Hps; ——: Pm, the same as below)

2.5 特異性試驗(yàn)結(jié)果 以兩種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，利用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法，對實(shí)驗(yàn)室保存的胸膜肺炎放線桿菌、沙門氏菌、豬鏈球菌、豬丹毒絲菌、大腸桿菌、Hps、Pm 的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該雙重?zé)晒舛縋CR僅對Hps、Pm 以及兩種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品有特異性擴(kuò)增，其余樣品均為陰性(圖3)。表明該方法特異性較強(qiáng)。

2.6 敏感性試驗(yàn) 采用常規(guī)PCR 法、單一及雙重?zé)晒舛縋CR 方法，分別對101拷貝/μL～108拷貝/μL 兩種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行敏感性檢測。結(jié)果顯示，雙重?zé)晒舛縋CR 方法對Hps 和Pm 的檢測限分別是5.60×102拷貝/μL 和7.58×102拷貝/μL 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，與單一熒光定量PCR 檢測數(shù)量級相同(圖4A、4B)。表明兩種不同特異性引物間干擾較小，多重體系中PCR 擴(kuò)增效率幾乎未受影響。常規(guī)PCR 結(jié)果顯示對兩種質(zhì)粒的檢測限均約為104拷貝/μL，比熒光定量PCR 敏感性低100 倍(圖4C)，表明熒光定量PCR 的敏感性較高，且高于常規(guī)PCR近100 倍。

圖3 特異性試驗(yàn)(--：Hps；——：Pm)Fig.3 Specific test of the duplex qPCR (--: Hps; ——: Pm)

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 以103拷貝/μL～107拷貝/μL 的兩種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物為模板，采用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果顯示組內(nèi)變異系數(shù)小于2 %，組間變異系數(shù)小于2.5 % (表2)。表明建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法具有較好的重復(fù)性。

2.8 臨床樣品檢測 分別采用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 法、常規(guī)PCR 法、細(xì)菌分離鑒定檢測臨床28份樣品。結(jié)果顯示，雙重?zé)晒舛縋CR 方法的陽性檢出率為53.57 % (15/28)，優(yōu)于常規(guī)PCR 方法的46.42 % (13/28)，且明顯高于細(xì)菌分離鑒定方法28.57 % (8/28)(表3)，表明雙重?zé)晒舛縋CR 方法敏感性更高，可以用于臨床樣品的檢測率。

3 討 論

近年來，Hps 已經(jīng)成為規(guī)模化養(yǎng)殖條件下引起保育豬死亡的典型細(xì)菌性疾病之一[3,15]，Pm 感染導(dǎo)致的豬肺疫也是引起豬死亡的一種常見傳染病，這兩種細(xì)菌性疾病在世界各地均有發(fā)生，且均能夠引起豬的呼吸道癥狀[16-17]。由于養(yǎng)殖場在豬發(fā)病后多使用大量抗生素，導(dǎo)致其細(xì)菌分離培養(yǎng)困難、分離鑒定準(zhǔn)確性低，再加之一些細(xì)菌對生長條件要求苛刻、生長緩慢，這不僅給疾病的診斷帶來了挑戰(zhàn)，還給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年實(shí)驗(yàn)室檢測的臨床樣本中，Hps 及Pm 的檢出率較高、比重偏大，且兩種細(xì)菌分離培養(yǎng)均較困難，因此為了提高檢測的效率及準(zhǔn)確性，本研究結(jié)合分子生物學(xué)手段，在已有檢測方法的基礎(chǔ)上，建立了同時檢測該兩種細(xì)菌的雙重?zé)晒舛縋CR 方法。

圖4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Sensitivity tests of the double qPCR, Single qPCR and conventional PCR

表2 雙重?zé)晒舛縋CR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability test of the duplex qPCR

表3 臨床樣品檢測結(jié)果Table 3 Results of clinical sample test

熒光定量PCR 是一種特異性強(qiáng)、敏感性高的核酸定量檢測技術(shù)。TaqMan 探針法結(jié)合了PCR 對核酸的高效擴(kuò)增、探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高敏感性[18-20]，且為完全封閉式反應(yīng)，降低了假陽性出現(xiàn)的幾率。通過比較，本研究建立的方法，敏感性比陳申秒等建立的Hps、Pm、胸膜肺炎放線桿菌多重PCR 檢測方法高104個數(shù)量級，且選擇構(gòu)建Hps、Pm 的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，較直接提取兩種細(xì)菌DNA 作為模板穩(wěn)定性好，檢測時間也從3 h 壓縮為1 h[21]。與朱新貴等建立的檢測Pm 和Hps 雙重及多重PCR 方法相比，該方法檢測時間更短、敏感性更高、操作更簡便[22]。本研究選取了Pm 的保守基因PlpE以及能夠特異性區(qū)分Hps 毒力株和非毒力株的OmpP2基因，使得該方法能夠更準(zhǔn)確檢測Pm和有效檢測未知樣品中的Hps 是否具有致病性。此外，設(shè)計的探針還能夠進(jìn)一步確保該檢測方法的特異性并實(shí)時監(jiān)測試驗(yàn)結(jié)果。

由于以兩種細(xì)菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的混合物為模板，再混合兩對引物及兩條探針，反應(yīng)的變量增多，優(yōu)化最適的反應(yīng)條件則較困難。因此，本研究先分別建立了檢測各細(xì)菌的單一熒光定量PCR 方法，縮小了需要優(yōu)化的反應(yīng)條件。在單一熒光定量PCR 優(yōu)化的各反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，再根據(jù)矩陣試驗(yàn)，優(yōu)化了混合體系的最佳反應(yīng)條件，使得反應(yīng)在1 h之內(nèi)就能完成。敏感性試驗(yàn)顯示，雙重?zé)晒舛縋CR 方法對Hps、Pm 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測限分別為5.60×102拷貝/μL、7.58×102拷貝/μL，與單一熒光定量PCR 檢測數(shù)量級相同，且比常規(guī)PCR 方法敏感性高100 倍，表明檢測兩種不同菌的特異性引物間干擾較小，雙重PCR 體系中的擴(kuò)增效率幾乎未受影響。因此，對基因組拷貝數(shù)低、分離困難的菌株也能夠盡可能地保證檢測的準(zhǔn)確性。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2.5 %，重復(fù)性和穩(wěn)定性也均較好，能夠縮小不同時間檢測的誤差。該方法檢測臨床樣本的結(jié)果顯示，該方法的檢出率優(yōu)于常規(guī)PCR，且明顯高于細(xì)菌的分離鑒定。常規(guī)PCR 的敏感性不及熒光定量PCR；細(xì)菌分離鑒定雖然是檢測細(xì)菌最準(zhǔn)確的方法，但培養(yǎng)條件的苛刻可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，因此雙重?zé)晒舛縋CR 方法具有更廣闊的的應(yīng)用前景。

總之，本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好、耗時短，使得其在臨床應(yīng)用上能夠在較短的時間排查病原，具有較大的應(yīng)用價值。