侯明飛 范 濤

（山東省寧陽縣行政審批服務(wù)局，山東寧陽 271400）

乳房炎是一種危害奶牛產(chǎn)業(yè)的重要疾病，不僅影響奶牛的產(chǎn)奶量，而且降低牛奶的品質(zhì)，影響人體健康，延長(zhǎng)奶牛產(chǎn)后發(fā)情和妊娠時(shí)間。奶牛乳房炎的發(fā)生較復(fù)雜，化學(xué)性刺激、物理性刺激，飼養(yǎng)管理不善等各種因素均可誘發(fā)，乳房感染致病性或條件致病性微生物，進(jìn)而發(fā)生乳房炎。引起奶牛乳房炎的病原微生物很多，有細(xì)菌、真菌、病毒、支原體等，但主要由細(xì)菌引起。據(jù)有關(guān)報(bào)道，奶牛乳房炎中以金黃葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌這五種細(xì)菌最為常見。

目前對(duì)奶牛乳房炎診斷和檢測(cè)有乳汁細(xì)胞學(xué)檢查法、乳汁pH檢查法和乳汁導(dǎo)電性檢查法等多種方法，但是這些方法存在繁瑣、耗時(shí)、費(fèi)力等缺點(diǎn)[1]。而PCR技術(shù)具有有效、快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，所以此次試驗(yàn)采用PCR技術(shù)檢測(cè)和鑒定這五種奶牛乳房炎主要病原菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

來自泰安地區(qū)奶牛場(chǎng)，采集牛奶約5～10 ml放入滅菌瓶中，作好標(biāo)記，冰浴中送回實(shí)驗(yàn)室，4℃保存，共47份。

1.1.2 引物

根據(jù)NCBI和相關(guān)文獻(xiàn)資料設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。詳細(xì)見表1。

表1 PCR反應(yīng)中的引物

1.1.3 試驗(yàn)試劑

2*power Taq PCR Mastermix購自BIOTEKE CORPORATION公司，DL2000 DNA Marker，藥敏片：慶大霉素、頭孢唑啉、紅霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、林可霉素、大觀霉素，營養(yǎng)瓊脂，兔血，其他。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

PCR儀購自Gene Amp公司，電泳儀，紫外凝膠成像儀，DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DKS12型電熱恒溫水浴鍋均購自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，紫外分析儀UV-型購自北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司，臺(tái)式高速離心機(jī)Neofuge13購自上海力申科學(xué)儀器有限公司，膠回收試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

奶樣搖勻，在無菌條件下接種到兔血培養(yǎng)皿，至37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，然后選取可疑菌落接種到營養(yǎng)瓊脂或兔血培養(yǎng)皿上，至37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，然后將細(xì)菌接種到液體培養(yǎng)基，至37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

1.2.2 提取DNA

取菌液1.5 ml至于離心管中，5 000r/min 4℃離心4min，棄上清，加入500 mL TE（ph8.0）煮沸10min，立即放入冰水中3min，1 000r/min 4℃ 離心3min，取上清，作為PCR模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 多重PCR

總反應(yīng)體系25 μl。包括Taq mix 12.5μl，模板1 μl，金黃葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌上下游引物各1 μl，水2.5 μl；Taq mix 12.5 μl，模板4 μl，乳房鏈球菌、停乳鏈球菌上下游引物各1 μl，水4.5 μl。放入PCR儀反應(yīng)。取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。

1.2.4 膠回收和PCR產(chǎn)物的鑒定

根據(jù)試劑盒進(jìn)行膠回收，DNA送往上海生工測(cè)序，與NCBI上發(fā)布的基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法，檢測(cè)上述五種細(xì)菌對(duì)上述七種藥敏片的敏感程度。調(diào)節(jié)菌液（上述1.2.1制備）濃度，取少量均勻涂于兔血培養(yǎng)皿中，用無菌鑷子夾起，按一定距離貼于培養(yǎng)皿中，于37℃恒溫培養(yǎng)24h。用直尺測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算同一種細(xì)菌不同藥敏片的平均抑菌圈直徑，直徑小于16 mm為不敏感，16～20 mm為中度敏感，大于20 mm為高度敏感。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

共47份樣品，44份樣品生長(zhǎng)出細(xì)菌。

2.2 PCR結(jié)果

金黃葡萄球菌檢測(cè)率為79%，大腸桿菌檢測(cè)率為72%，無乳鏈球菌檢測(cè)率為2%，停乳鏈球菌檢測(cè)率為20%，乳房鏈球菌檢測(cè)率為18%，奶牛多為混合感染，單獨(dú)感染極少。

2.3 DNA測(cè)序

經(jīng)過測(cè)序，PCR擴(kuò)增的序列分別與NCBI發(fā)布的基因序列基本一致，同源性高達(dá)98%以上。利用多重PCR擴(kuò)增的DNA片段，分別與各種細(xì)菌的基因片段同源，PCR的鑒定結(jié)果，能夠作為該種細(xì)菌存在的驗(yàn)證。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選用慶大霉素、紅霉素、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、卡那霉素、林可霉素、大觀霉素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果見表2。

表2 幾種藥物對(duì)細(xì)菌的平均抑菌圈直徑（單位：mm）

3 討論

奶牛乳房炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，在我國奶牛乳房炎發(fā)病數(shù)量一直很高，所產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失在奶牛疾病中居于首位。引起奶牛乳房炎的原因主要有兩方面：第一是由環(huán)境因素引起的，如病原菌通過泥土、糞便等傳播感染牛，該途徑感染的病菌主要有乳房鏈球菌、大腸桿菌等；第二方面，是通過擠奶感染，如擦洗乳房用的毛巾、水等接觸傳播，該途徑多為傳染性病原菌感染，如無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌。因此，保持牛舍清潔、牛身體的衛(wèi)生、避免交叉感染，是預(yù)防奶牛乳房炎的重要措施。

目前，奶牛乳房炎病原菌的檢測(cè)，主要靠細(xì)菌微生物學(xué)培養(yǎng)和生化試驗(yàn)。有時(shí)診斷隱性乳房炎產(chǎn)生假陰性結(jié)果、乳汁中存在較高體細(xì)胞數(shù)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)、工作量很大并至少需要 2～ 3d 時(shí)間才能做出鑒定，有許多局限性。在臨床條件下，快速、有效的對(duì)病原做出檢測(cè)對(duì)奶牛乳房炎的防治非常重要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是 PCR 技術(shù)的完善與應(yīng)用，使得對(duì)乳房炎病原菌的檢測(cè)可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。

細(xì)菌耐藥性與抗菌藥物長(zhǎng)期使用有關(guān)，在臨床治療選擇幾種比較敏感的藥物合用或交替使用，減少單個(gè)藥物的使用劑量或使用時(shí)間，可減緩耐藥菌株的產(chǎn)生。因此，臨床治療可根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，并綜合考慮藥物的成本和安全等因素，盡可能選擇有效的抗菌藥物，減少耐藥菌株的出現(xiàn)。目前已有大量報(bào)道表明，中藥在奶牛乳房炎防治中起到重要作用。除藥物防治外，更應(yīng)保持奶牛圈舍環(huán)境的清潔、衛(wèi)生、通風(fēng)、干燥，建立合理的飼養(yǎng)管理制度，從根本上減少奶牛乳房炎的發(fā)病。因此控制奶牛乳房炎的發(fā)生，除了選擇敏感的藥物進(jìn)行治療外，還必須采取一系列綜合預(yù)防措施。