蔣海彬

【摘要】 目的：在妊娠期缺氧子代SD大鼠應(yīng)用脂多糖，以研究TLR4受體在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。方法：將20只鼠齡8月妊娠期缺氧雄性子代大鼠分為兩組（G2）和（G4），每組10只，分別給予腹腔注射生理鹽水（等容積）或脂多糖（2.5 mg/kg），將20只妊娠期缺氧空白對(duì)照雄性子代大鼠（G1）和（G3）作相應(yīng)處理，每周2次，連續(xù)注射8周。于12月齡后處死大鼠。采用ELISA檢測(cè)大鼠血清中炎癥相關(guān)因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β的水平，Real time-PCR檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈組織中NF-κB p65與TLR4 mRNA表達(dá)。結(jié)果：G3和G4組炎癥相關(guān)因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平升高（P<0.05），主動(dòng)脈組織中TLR4、NF-κBp65 mRNA的表達(dá)明顯升高（P<0.05），并且G4最高（P<0.05）。結(jié)論 脂多糖可以引起主動(dòng)脈炎癥反應(yīng)。通過TLR4/NF-κB信號(hào)途徑的激活，TLR4受體在動(dòng)脈粥樣硬化中起到了重要的作用。

【關(guān)鍵詞】 Toll樣受體4; 動(dòng)脈粥樣硬化; 核因子-κB; 妊娠期缺氧

【Abstract】 Objective：To investigate the pathologic mechanisms of TLR4 in atherosclerosis after TLR4 agonists（LPS）were administered to offspring rats from hypoxia during pregnancy.Method：Twenty female offspring rats from hypoxia during pregnancy aged 8 months were randomized into two groups（G2）and（G4）with 10 in each group. Saline（isovolumic normal saline）and LPS（2.5 mg/kg）were administered respectively by intraperitoneal injection，twice a week. Corresponding interventions were given to offspring rats（G1）and（G3），from control group during pregnancy and compared with offspring rats from hypoxia during pregnancy. After treatment 8 weeks，the ELISA was used to measure the IFN-γ，TNF-α，IL-1β of serologic inflammatory cytokines，and the real time-PCR was used to measure the TLR4 and NF-κB p65 mRNA expressions in aortic sinus specimens aortic sinus.Result：The levels of immune inflammatory mediators（IFN-γ，TNF-α，IL-1β）rose significantly in group G3 and G4（P<0.05）. Simultaneously，TLR4 and NF-κB p65 mRNA expressions in the aorta tissue of group G3 and G4 were enhanced（P<0.05）.In addition，the above-mentioned parameters were more obvious in group G4（P<0.05）.Conclusion：Inflammatory response occurred in the aorta tissue in rats after LPS exposure. TLR4 receptor revealed an important role in inflammatory injury of the aorta tissue after LPS stimulation by the activation of TLR4/NF-κB signal pathway.

【Key words】 Toll-like receptor 4; Atherosclerosis; Nuclear factor-kappa B; Hypoxia during pregnancy

First-authors address：NO.2 Hospital Affiliated to Xiamen Medical College，Xiamen 361000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.10.002

目前，心血管疾病等慢性病對(duì)人類健康造成了重大影響，既往大量研究表明吸煙、高血壓、肥胖等為其確定的危險(xiǎn)因素，但上述原因并不能完全解釋心血管疾病的流行。有研究表明，在排除后天社會(huì)行為的因素的前提下，產(chǎn)前營養(yǎng)不良、出生體重低、產(chǎn)后營養(yǎng)狀況與冠心病也存在較強(qiáng)的相關(guān)性[1]，上述研究表明產(chǎn)前與早期出生后相關(guān)因素也是心血管疾病的危險(xiǎn)因素。作為心血管疾病的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）被認(rèn)為是一種“炎性疾病”。炎癥伴隨著AS的發(fā)展，其一個(gè)常見特征是細(xì)胞因子上調(diào)。作為一組Ⅰ型跨膜模式識(shí)別受體（transmembrane pattern-recognition receptors，PRRs）[2]，Toll樣受體是（Toll-like receptors，TLRs）的特異配體包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。當(dāng)細(xì)胞受LPS刺激時(shí)，LPS-LPS結(jié)合蛋白（LBP）復(fù)合物結(jié)合到細(xì)胞表面CDl4/TLRs受體，通過髓樣分化蛋白88（Myeloid differentiation protein 88，MyD88）依賴或非依賴MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）和活化蛋白激酶信號(hào)通路進(jìn)而各種炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)上調(diào)[3-4]，炎性介質(zhì)水平上調(diào)[5-6]。本研究旨在通過對(duì)妊娠期缺氧子代Sprague-Dawley（SD）大鼠腹腔注射LPS，觀察血中炎癥因子[主要包括白介素IL-1β（interleukin1 IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和干擾素-（Interferon-γ，IFN-γ）]、TLR4及下游NF-B在主動(dòng)脈中的表達(dá)，以研究LR4受體在AS中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 建立動(dòng)物模型

1.1.1 對(duì)象 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠24只（16周齡，體重360～400 g），健康清潔級(jí)雌性SD大鼠24只（12周齡，體重200～250 g），均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將雄雌大鼠按1：1比例隨機(jī)合籠，妊娠期缺氧及空白對(duì)照下所孕育子代SD雄性大鼠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究的研究因素是妊娠期缺氧和子代大鼠成年后腹腔注射LPS，研究其對(duì)AS的影響。實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)分組的兩因素兩水平析因設(shè)計(jì)，子代雄性大鼠共分四組，正常組（G1）、妊娠期缺氧組（G2）、腹腔注射內(nèi)毒素組（G3）和妊娠期缺氧再腹腔注射內(nèi)毒素組（G4），每組10只，窩別、鼠齡、體重、動(dòng)物飼養(yǎng)等因素匹配。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.3.1 建立妊娠期缺氧模型 將雄雌大鼠按1︰1比例隨機(jī)合籠，采用托盤法每半天檢查1次是否有陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓為妊娠第0天。然后將妊娠大鼠隨機(jī)分為兩組，即分別于妊娠第1天開始缺氧和空白對(duì)照組，每組各6只。將妊娠大鼠分批置入缺氧箱內(nèi)，氮?dú)夂脱鯕夥謩e通過四個(gè)進(jìn)氣孔通入（每種兩孔），內(nèi)置小電扇將輸入的氣體不斷混勻，出氣通路使用單向活瓣，箱內(nèi)外大氣壓通過箱體預(yù)留小縫隙與箱外大氣相通從而保持平衡。同時(shí)在箱內(nèi)放置堿石灰和氯化鈣（用于吸收CO2和水蒸氣）。維持箱內(nèi)溫度19～23 ℃，濕度64%～68%，CO2濃度<3%，將箱內(nèi)氧氣濃度控制于（10±1）%（通過S-450型氧氣檢測(cè)報(bào)警儀監(jiān)測(cè)以實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)氮?dú)夂脱鯕獾牧髁浚?。于箱體內(nèi)處理3 h后取出動(dòng)物，每天重復(fù)上述過程直至大鼠分娩。對(duì)照組孕鼠置于同樣的缺氧箱內(nèi)，持續(xù)通入空氣，保持箱內(nèi)與箱外氧濃度一致，處理時(shí)間與缺氧組相同。

1.1.3.2 建立腹腔注射內(nèi)毒素動(dòng)物模型 對(duì)鼠齡、窩別、體重等因素進(jìn)行匹配后，隨機(jī)取上述孕鼠子代雄性大鼠，體重300～350 g，鼠齡8月，共分四組，正常組（G1）、妊娠期缺氧組（G2）、腹腔注射內(nèi)毒素組（G3）和妊娠期缺氧再腹腔注射內(nèi)毒素組（G4），每組10只。將 20只鼠齡8月妊娠期缺氧雄性子代大鼠分為兩組（G2）和（G4），分別給予腹腔注射生理鹽水（等容積）或脂多糖（2.5 mg/kg，250 μg/mL）（sigma公司，美國），將20只妊娠期缺氧空白對(duì)照雄性子代大鼠（G1）和（G3）進(jìn)行相應(yīng)處理并做比較，每周兩次，連續(xù)注射8周。在相同條件下飼養(yǎng)，共持續(xù)8周，喂養(yǎng)至12月齡。大鼠的飼養(yǎng)及處理經(jīng)過福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷與應(yīng)用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 留取大鼠血及組織標(biāo)本 于12月齡，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30～45 mg/kg）麻醉后，分離腹主動(dòng)脈，插管采集血液標(biāo)本，測(cè)相關(guān)指標(biāo)。截取整段胸腹主動(dòng)脈，置于凍存管中液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.3 ELISA檢測(cè)IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平應(yīng)用ELISA試劑盒干擾素-（IFN-γ，上?？祈樕锟萍加邢薰荆?、腫瘤壞死因子（TNF-α，南京森貝伽生物科技有限公司）和白介素IL-1β（IL-1β，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）檢測(cè)血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β的水平。

1.4 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)TLR4、NF-κB p65的mRNA水平 主動(dòng)脈組織提取總RNA。根據(jù)cDNA合成試劑盒將5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（Takara公司，日本）。使用實(shí)時(shí)PCR試劑盒（Takara公司，日本）進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體積20 μL，其中cDNA2 μL，上下游引物各0.4 μL，實(shí)時(shí)PCR試劑10 μL，去離子水7.2 μL，陰性對(duì)照組以雙蒸水代替模板。標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)參為GAPDH。引物序列：TLR4上游引物（5-ATGTTGTGGCTACTATAGGC-3）、下游引物（5-GGCCACTTTCGTGACTTCGAA-3）;NF-κB p65上游引物（5-TCCTTCTCGCGTGACAATCGA-3）、下游引物（5-ATTGGATCTAAGG GATCACGC-3）;內(nèi)參GADPH上游引物（5-AGACTGTCGTCCGTGGA CTCG-3）、下游引物（5-TGGGGCCAGAGAGGTCATTCCCA-3）。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，循環(huán)1次;變性95 ℃ 5 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循環(huán)共40次;65 ℃ 10 s，循環(huán)1次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，血炎性因子與主脈組織內(nèi)mRNA表達(dá)等定量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各大鼠一般情況及主動(dòng)脈切片情況 妊娠期缺氧組出現(xiàn)出生低體重后追趕生長(zhǎng)，至5月齡時(shí)，體重已無區(qū)別。注射生理鹽水的各對(duì)照組大鼠飲食與活動(dòng)良好，無意外及死亡，毛發(fā)光滑;注射LPS組大鼠未出現(xiàn)死亡，但活動(dòng)明顯遲滯，毛發(fā)紊亂、精神萎靡。對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象主動(dòng)脈根進(jìn)行切片染色顯示，只有妊娠期缺氧子代大鼠LPS組主動(dòng)脈根部?jī)?nèi)膜增厚，部分斑塊形成，不同程度的炎細(xì)胞浸潤于血管外膜。

2.2 各組血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β濃度比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)LPS作用后，G3和G4組IFN-γ、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平血清水平較鹽水組明顯升高（P<0.05），且妊娠期缺氧注射LPS（G4）組最高（P<0.05）。見表1。

2.3 主動(dòng)脈組織TLR4和NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)LPS作用后，G3和G4組TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平較鹽水組明顯升高（P<0.05），且妊娠期缺氧注射LPS（G4）組最高（P<0.05）。見表2。

3 討論

AS是一種“炎癥性疾病”，血管內(nèi)膜炎性損傷及修復(fù)參與了AS的形成過程。體內(nèi)多種細(xì)胞通過相關(guān)因子相互作用，促進(jìn)了AS的發(fā)生發(fā)展，TLRs在其中起著重要作用。機(jī)體可通過免疫細(xì)胞表面的TLR識(shí)別病原相關(guān)分子模式（主要包括LPS和脂磷壁酸、膜脂蛋白、糖脂肽和某些病毒DNA等）。TLRs與配體結(jié)合后通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活NF-κB，影響細(xì)胞因子的合成與釋放，促進(jìn)或抑制炎癥。TLR4特異性地識(shí)別LPS，是LPS誘發(fā)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵[7]，是LPS激活NF-κB的上游機(jī)制[8]，能夠持續(xù)誘導(dǎo)NF-κB的活性，上調(diào)炎癥因子，介導(dǎo)誘發(fā)炎性反應(yīng)[9-10]。LPS可直接作用于TLR4受體，上調(diào)其表達(dá)[11]，也可作用于細(xì)胞表面的CD14，通過LPS/CD14復(fù)合物[12]，上調(diào)TLR4受體的表達(dá)，其表達(dá)量與促炎性介質(zhì)的釋放量有關(guān)[13]。TLR4表達(dá)上調(diào)可大量激活NF-κB，NF-κB即可由胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)多種細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-1β）基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞激活[14]。

慢性心血管疾病病理生理過程中存在性別差異，雌性可能存在保護(hù)作用，故本研究中把研究對(duì)象設(shè)為雄性子代大鼠。妊娠期缺氧與子代出生低體重有關(guān)，在本研究中也得以體現(xiàn)。當(dāng)條件恢復(fù)后生長(zhǎng)抑制大鼠出現(xiàn)追趕生長(zhǎng)（代償性的快速生長(zhǎng)）。本研究妊娠期缺氧組3月齡前的追趕生長(zhǎng)比較明顯，至5月齡時(shí)，體重已無差別。本研究結(jié)果中，經(jīng)LPS作用后，G3和G4組主動(dòng)脈組織TLR4和NF-κB p65 mRNA及血清學(xué)IFN-γ、TNF-α和IL-1β 表達(dá)水平較鹽水組明顯升高（P<0.05）;且宮內(nèi)缺氧LPS組G4最高（P<0.05），證明LPS能夠刺激主動(dòng)脈組織等細(xì)胞TLR4，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，啟動(dòng)IFN-γ、TNF-α和IL-1β細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞激活同時(shí)，展示了TLR4通路介導(dǎo)的炎癥損傷，提示脂多糖在妊娠期缺氧模型中較容易誘導(dǎo)AS，表明妊娠期缺氧是AS的危險(xiǎn)因素，但不一定單獨(dú)致病，而是在后天環(huán)境刺激過程中得以體現(xiàn)。TLR4通路在AS與宮內(nèi)缺氧的關(guān)系中可能起到了橋梁及加速的作用。LPS引起的人類血管外膜成纖維細(xì)胞的脂質(zhì)沉積主要是通過TLR4/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)[15]。TNF-α通過激活NF-B信號(hào)通路在AS中起作用。細(xì)胞中的NF-κB在未受到活化時(shí)不具有相關(guān)功能。此時(shí)，被結(jié)合的NF-κB P65亞基覆蓋P50亞基的核定位信號(hào)，蛋白復(fù)合體被“囚禁”在細(xì)胞質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用無法發(fā)揮[16]。當(dāng)細(xì)胞受到LPS等細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，蛋白激酶被激活，致使結(jié)合在NF-κB P65亞基上的蛋白N端調(diào)節(jié)區(qū)Ser32/36磷酸化，然后該區(qū)內(nèi)的兩個(gè)賴氨酸殘基結(jié)合泛素蛋白，受蛋白酶小體的作用而裂解，NF-κB獲得了自由，迅速從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核[17]。在體內(nèi)，NF-κB的活化過程受到精細(xì)調(diào)控，會(huì)與其他炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有交匯作用，其主要的調(diào)節(jié)方式為反饋調(diào)控。具體有兩種調(diào)節(jié)途徑：（1）正反饋調(diào)節(jié)（細(xì)胞內(nèi)），TNF-α和IL-1β轉(zhuǎn)錄基因受活化后的NF-κB增強(qiáng)，從而釋放大量TNF-α和IL-1β，最后NF-κB被激活;（2）負(fù)反饋調(diào)節(jié)（細(xì)胞內(nèi)外），在胞內(nèi)，NF-κB可特異識(shí)別其抑制蛋白基因順式作用元件，調(diào)控其抑制蛋白轉(zhuǎn)錄，NF-κB活化后，其抑制蛋白轉(zhuǎn)錄亦被上調(diào)，在胞外，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-10受LPS、TNF-α和IL-1β的刺激而大量出現(xiàn)，然后內(nèi)毒素誘導(dǎo)的NF-κB活化被IL-10阻斷，促炎細(xì)胞因子受到抑制，急性炎癥反應(yīng)中斷[18-20]。本研究中，妊娠期缺氧在追趕生長(zhǎng)中，可能存在炎癥反應(yīng)及其正反饋調(diào)節(jié)，而在受到LPS刺激后，易受激發(fā)。

本研究腹腔內(nèi)注射LPS致AS發(fā)病過程中，LPS通過TLR4/NF-κB 途徑引起血管炎癥反應(yīng)，即激活TLR4，活化NF-κB ，誘發(fā)炎性因子，趨化炎性細(xì)胞至血管內(nèi)皮下，最終導(dǎo)致AS的形成和發(fā)展，為AS始于血管內(nèi)皮損傷之學(xué)說提供佐證，在跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的“源頭”水平上進(jìn)一步認(rèn)識(shí)AS發(fā)病機(jī)制。AS的形成和發(fā)展中，各種交匯作用非常廣泛和復(fù)雜，并且不同的細(xì)胞和不同的狀態(tài)時(shí)效應(yīng)有所不同，其精確的相互作用及調(diào)控機(jī)制仍然是重要的研究方向。

參考文獻(xiàn)

[1] Parikh N I，Jeppson R P，Berger J S，et al.Reproductive Risk Factors and Coronary Heart Disease in the Womens Health Initiative Observational Study[J].Circulation，2016，133（22）：2149-2158.

[2] Zinngrebe J，Walczak H.TLRs Go Linear-On the Ubiquitin Edge[J].Trends Mol Med，2017，23（4）：296-309.

[3] Wu X，Gowda N M，Kawasawa Y I，et al.A malaria protein factor induces IL-4 production by dendritic cells via PI3K-Akt-NF-κB signaling independent of MyD88/TRIF and promotes Th2 response[J].J Biol Chem，2018，293（27）：10425-10434.

[4]李紅梅，王顯.TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2017，9（9）：1132-1134.

[5] Yang H，Li J，Wang Y，et al.Role of CD14 and TLR4 in type I，type Ⅲ collagen expression.synthesis and secretion in LPS-induced normal human skin fibroblasts[J].Int J Clin Exp Med，2015，8（2）：2429-2434.