周向陽(yáng) 趙 亮 狄佳春 陳旭升,*

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江蘇南京 210095；2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,江蘇南京 210014

國(guó)外轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的研究較早。1981年,Schnepfh等[1]首次從菌株HD-1 中克隆出蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白基因,并證明其抗蟲能力。1987年美國(guó)Agrocetus公司對(duì)Bt基因有關(guān)的DNA 序列片段進(jìn)行了必要的修飾,然后利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入并整合到棉株的基因組中,使棉株成功地表達(dá)出抗蟲性狀,但其抗蟲能力不高,主要因?yàn)锽t基因來(lái)源于原核生物,序列富含A、T 堿基,在棉花植株中不易表達(dá)[2]。1989年,Monsanto 公司對(duì)單價(jià)Bt基因進(jìn)行改造,即在不改變殺蟲晶體蛋白氨基酸序列的情況下,采用人工合成和點(diǎn)突變的方法,對(duì)Bt基因的特定位點(diǎn)進(jìn)行改造,把序列中的A、T 堿基換成G、C 堿基,選取了適于棉花的啟動(dòng)子,并在Bt基因所在位置的上游增加了增強(qiáng)子,然后把改造的Bt基因?qū)朊拗?。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Bt基因未改造之前相比,殺蟲晶體蛋白在棉花植株中的表達(dá)量由原來(lái)的0.001%提高到0.05%～0.10%,抗蟲能力達(dá)70%以上[3]。1995年,美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)首次通過(guò)了轉(zhuǎn)Bt基因棉的種植申請(qǐng),并開(kāi)始在美國(guó)國(guó)內(nèi)大面積推廣生產(chǎn)轉(zhuǎn)Bt基因棉。1996年,Monsanto 公司與岱字棉公司首次合作,開(kāi)展轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的選育和商業(yè)化工作,保鈴棉33B 是其代表性品種[4-5]。

我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的研究較晚,但進(jìn)展迅速。1991年,謝道昕等[6]首次報(bào)道將Bt基因利用花粉管通道法導(dǎo)入本土棉花品種之中,獲得具有外源Bt基因的轉(zhuǎn)基因棉花植株,但抗蟲性能較差。1992年,郭三堆等[7]首先設(shè)計(jì)并人工合成了具有高效殺蟲活性的GFM Cry1A殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)基因,并于1994年導(dǎo)入棉花植株,經(jīng)過(guò)鑒定確認(rèn)外源Bt基因已整合到棉花基因組中。在此基礎(chǔ)上與育種單位合作,成功選育出GK1、GK12、GK19、GKZ1 和晉棉26 等中國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種,使中國(guó)成為繼美國(guó)之后的第二個(gè)能自主研發(fā)利用轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的國(guó)家[8]。

本研究以中國(guó)和美國(guó)的2 個(gè)主要抗蟲棉品種GK19 與33B 為試驗(yàn)材料,通過(guò)PCR 檢測(cè)技術(shù)對(duì)中美Bt基因進(jìn)行分子鑒定,進(jìn)一步通過(guò)SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)Bt基因進(jìn)行染色體定位,旨在從外源基因轉(zhuǎn)化事件的視角探究中美轉(zhuǎn)基因抗蟲棉差異的分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取中國(guó)抗蟲棉GK19、美國(guó)抗蟲棉33B,以及非轉(zhuǎn)基因海島棉“勝利1 號(hào)”、陸地棉“泗棉3 號(hào)”為試驗(yàn)材料。在江蘇省農(nóng)科院南京試驗(yàn)田種植雜交F1代(GK19×勝利1號(hào)、33B×勝利1 號(hào)),開(kāi)花期做自交、吐絮期收自交鈴,而后室內(nèi)軋花獲得的種子即為F2代分離群體。將以上2 個(gè)海陸雜交F2代分離群體作為Bt基因的定位群體,其中[GK19×勝利1 號(hào)] F2代群體的個(gè)體數(shù)為184 粒種子,[33B×勝利1 號(hào)] F2代群體的個(gè)體數(shù)為185 粒種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子DNA 的提取 取親本以及雜交F1、F2的種子,每粒種子即為1 個(gè)個(gè)體。剝種殼得種仁,采用匡猛等[9]的方法提取單粒種子DNA。

1.2.2Bt基因來(lái)源的分子檢測(cè) 中美Bt基因PCR 擴(kuò)增檢測(cè)的特異性引物序列來(lái)自王奕海等[10]的報(bào)道,中國(guó)Bt基因的擴(kuò)增片段大小為456 bp,美國(guó)Bt基因的擴(kuò)增片段大小為310 bp。特征引物序列為：F-1：5′-CATCTTCACTC GGTAACATCG-3′(456 bp)；F-2：5′-AGGGAACCTTCATC GTGG-3′(310 bp)；R：5′-ATACGTGCCAAGTGCCAACC-3′。

利用檢測(cè)Bt基因的特異性引物分別對(duì)抗蟲棉GK19、33B、清水、非抗蟲棉對(duì)照“泗棉3 號(hào)”進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在恒壓90V 條件下,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察目的基因片段。

1.2.3 多態(tài)性標(biāo)記篩選 SSR 引物系列來(lái)自Cotton Marker Database(網(wǎng)址http：//www.cottonmarker.org/)。從F2代分離群體,選取含Bt基因的個(gè)體10 個(gè),不含Bt基因的個(gè)體10 個(gè),“有”、“無(wú)”個(gè)體特征條帶清晰明顯。然后用scandrop250 超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定選取個(gè)體的DNA濃度,統(tǒng)一稀釋成40 ng μL-1后,吸取等體積的DNA 溶液,構(gòu)建近等基因混池。

利用本實(shí)驗(yàn)室自主篩選獲得的234 對(duì)核心引物(它們相對(duì)均勻地分布于棉花26 對(duì)染色體上,每對(duì)染色體上平均分布9 對(duì)核心引物)[11],對(duì)雙親以及近等基因混池進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,篩選多態(tài)性SSR 引物。

1.2.4Bt基因的染色體定位 用篩選獲得的多態(tài)性引物對(duì)F2群體的各個(gè)體DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；而后經(jīng)非變性PAGE 凝膠電泳,通過(guò)銀染檢測(cè)[12],得F2代各個(gè)體的標(biāo)記基因型。在燈箱上觀察多態(tài)性條帶,統(tǒng)計(jì)F2代各個(gè)體的標(biāo)記基因型,將與母本帶型相同的個(gè)體基因型記為“1”；與父本帶型相同的個(gè)體基因型記為“2”；共顯性雜合帶型記為“3”；缺失或無(wú)法辨別的帶型記為“0”。進(jìn)行卡方適應(yīng)性檢測(cè),并驗(yàn)證標(biāo)記分離比例是否符合3∶1 的孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。再利用JoinMap 4.0 軟件進(jìn)行分子標(biāo)記的連鎖分析,以鎖定目的引物與染色體；然后合成目的染色體上的SSR 引物進(jìn)行圖譜加密,實(shí)現(xiàn)Bt基因的染色體定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)Bt 抗蟲基因的PCR 檢測(cè)結(jié)果

利用檢測(cè)中美Bt基因的特異性引物,分別對(duì)抗蟲棉親本GK19 和33B 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,并以清水、非抗蟲棉品種“泗棉3 號(hào)”作為對(duì)照。通過(guò)PCR 擴(kuò)增,依據(jù)擴(kuò)增條帶大小進(jìn)行分子鑒定。由圖1可以看出,抗蟲棉品種GK19的PCR 擴(kuò)增條帶,符合中國(guó)Bt抗蟲基因設(shè)計(jì)引物的特征片段長(zhǎng)度456 bp(泳道1),顯示GK19 為中國(guó)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉。而抗蟲棉33B 的PCR 擴(kuò)增條帶,則擬合美國(guó)Bt抗蟲基因設(shè)計(jì)引物的特征片段長(zhǎng)度310 bp(泳道2),顯示33B 為美國(guó)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉。清水(泳道3)與對(duì)照品種“泗棉3 號(hào)”(泳道4)則無(wú)特征擴(kuò)增條帶。

2.2 Bt 基因在海陸雜交F2 代群體的分離規(guī)律

父本GK19 全部個(gè)體均含有中國(guó)Bt基因,母本“勝利1 號(hào)”全部個(gè)體均不含Bt基因。F1代全部個(gè)體均有中國(guó)Bt基因,F2代分離群體中含Bt基因和不含Bt基因的個(gè)體數(shù)目擬合3∶1 的分離比例(圖2和表1)。結(jié)果表明,該Bt基因?yàn)閱挝稽c(diǎn)插入,符合由一對(duì)顯性基因控制的孟德?tīng)柗蛛x規(guī)律。

圖1 Bt 基因類型鑒定 Fig.1 Identification of exogenous Bt genes

圖2 中國(guó)產(chǎn)Bt 基因的PCR 擴(kuò)增 Fig.2 PCR amplification of Bt gene from China

表1 GK19 和勝利1 號(hào)雜交后代Bt 基因的分離情況 Table1 Bt gene separation in hybrid offspring of GK19 crossing V-1

父本33B 及其F1代全部個(gè)體均含有美國(guó)Bt基因,母本“勝利1 號(hào)”全部個(gè)體均不含美國(guó)Bt基因。F2代分離群體中“有”與“沒(méi)有”Bt基因的個(gè)體數(shù)目擬合3∶1 的分離比例(圖3和表2)。表明該Bt基因也是單位點(diǎn)插入,符合由1 對(duì)顯性基因控制的孟德?tīng)柗蛛x規(guī)律。

2.3 中美抗蟲棉Bt 基因染色體定位

2.3.1 GK19 中Bt基因的連鎖遺傳圖譜 對(duì)海陸雜交組合“GK19×勝利1 號(hào)”的親本及F2近等基因池進(jìn)行差異性篩選,共得到22 對(duì)多態(tài)性引物。以這22 對(duì)多態(tài)性引物檢測(cè)F2代作圖群體每個(gè)單株的標(biāo)記基因型。通過(guò)連鎖軟件分析,發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記 NAU2579 與Bt抗蟲基因連鎖,且為共顯性標(biāo)記,兩者的初始遺傳距離為3.3 cM。由于標(biāo)記NAU2579 位于第20 染色體,據(jù)此初步推斷該Bt基因位于第20 染色體。查閱棉花最新遺傳圖譜,合成位于該SSR標(biāo)記上下遺傳距離50 cM 區(qū)間的83 對(duì)引物,通過(guò)對(duì)雙親篩選得到20 對(duì)多態(tài)性引物。用這些引物檢測(cè)F2代群體每個(gè) 單株的標(biāo)記基因型,然后通過(guò)JoinMap 4.0 軟件進(jìn)行遺傳連鎖分析。結(jié)果表明,共有 NAU2579、NAU2698、NAU2888、NAU3531、NAU3813、NAU3907、NAU5013、NAU5307、NAU6219、BNL119、BNL1253、BNL2570、BNL3646、dPL0108、Gh564、cgr6022 這16 對(duì)標(biāo)記與Bt基因連鎖。位于Bt基因兩側(cè)的分子標(biāo)記分別為NAU3907和NAU2579,遺傳距離分別為2.4 cM 和1.5 cM。由此將抗蟲棉品種GK19 所含的中國(guó)Bt基因定位在棉花第20 染色體上(圖4)。

圖3 美國(guó)Bt 基因的PCR 擴(kuò)增 Fig.3 PCR amplification of Bt gene from USA

表2 33B×勝利1 號(hào)雜交后代Bt 基因的分離情況 Table2 Bt gene separation in hybrid offspring of 33B crossing V-1

圖4 抗蟲棉GK19 的外源Bt 基因連鎖遺傳圖譜 Fig.4 Exogenous Bt gene linkage map of insect-resistant cotton GK19

2.3.2 33B 中的Bt基因的連鎖遺傳圖譜 對(duì)海陸雜交組合“33B×勝利1 號(hào)”的親本及其F2近等基因池進(jìn)行篩選,共得到37 對(duì)多態(tài)性引物。以這37 對(duì)多態(tài)性引物檢測(cè)F2代作圖群體每個(gè)單株的標(biāo)記基因型,通過(guò)連鎖軟件分析發(fā)現(xiàn),多態(tài)性標(biāo)記NAU2912 和Bt抗蟲基因連鎖,且為共顯性標(biāo)記,兩者的初始遺傳距離約為29.5 cM。由于標(biāo)記NAU2912 位于第26 染色體,由此初步推斷該Bt基因位于第26 染色體。查閱最新棉花遺傳圖譜,合成位于該標(biāo)記上下遺傳距離50 cM 區(qū)間的111 對(duì)引物,通過(guò)對(duì)雙親及F1代和近等基因池篩選得到23 對(duì)多態(tài)性引物。用這些引物檢測(cè)F2代群體每個(gè)單株的標(biāo)記基因型,然后通過(guò)JoinMap 4.0 軟件進(jìn)行遺傳連鎖分析。結(jié)果表明,共有20 對(duì)標(biāo)記與Bt基因連鎖,它們分別是標(biāo)記 NAU460、NAU2912、NAU3236、NAU3293、NAU3920、NAU4089、NAU4912、HAU1292、HAU2027、BNL3482、BNL3537、cgr5787、cgr5793、cgr6471、cgr6702、CIR085、dPL0380、dPL0796、dc40260、Gh568。位于Bt基因兩側(cè)的分子標(biāo)記分別為NAU460 和dc40260,遺傳距離分別為3.6 cM 和2.0 cM(圖5)。由此,將抗蟲棉種質(zhì)系33B 所含的美國(guó)Bt基因定位在棉花第26 染色體上。

圖5 抗蟲親本33B 的外源Bt 基因連鎖遺傳圖譜 Fig.5 Exogenous Bt gene linkage map of insect-resistant cotton 33B

3 討論

3.1 外源基因?qū)肱c遺傳轉(zhuǎn)化事件

外源基因?qū)朊藁〞?huì)產(chǎn)生不同的遺傳轉(zhuǎn)化事件。燕樹鋒等[13]分析轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花的遺傳情況,檢測(cè)26 個(gè)抗草甘膦棉花轉(zhuǎn)化事件,只有20 個(gè)轉(zhuǎn)化事件分離符合3∶1的分離規(guī)律,其他6 個(gè)轉(zhuǎn)化事件出現(xiàn)了偏分離,顯示轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的整合和遺傳機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜,并非完全遵從經(jīng)典的孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。不同轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入外源基因,其獲得遺傳轉(zhuǎn)化事件的拷貝數(shù)也不盡相同[14]。

轉(zhuǎn)基因作物的育種研發(fā)涉及多個(gè)環(huán)節(jié),最關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)是如何把外源基因成功導(dǎo)入受體材料,最終篩選出結(jié)構(gòu)完整、表達(dá)良好的轉(zhuǎn)基因品系,從而形成具有商業(yè)推廣價(jià)值的“轉(zhuǎn)化事件”(Transgenic event)[15]。目前的生物技術(shù)仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合,外源基因在受體基因組中的插入位點(diǎn)具有一定的隨機(jī)性,插入受體的染色體位置不同,其側(cè)翼序列也將表現(xiàn)不同；因此將產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)化事件。本研究顯示,外源Bt抗蟲基因?qū)腙懙孛?既可以獲得插入棉花第20 染色體轉(zhuǎn)化事件,育成商業(yè)化品種GK19；也可以獲得插入棉花第26 染色體的轉(zhuǎn)化事件,育成商業(yè)化品種33B。

3.2 不同基因定位方法的特色

棉花經(jīng)典遺傳學(xué)的定位方法是使用顯性遺傳多基因系T586 和隱性遺傳多基因系T582,通過(guò)配置雜交組合,對(duì)雜交后代目標(biāo)性狀的連鎖關(guān)系進(jìn)行分析,以實(shí)現(xiàn)突變基因(或外源基因)的染色體定位。由于以上2 個(gè)遺傳系連鎖的形態(tài)標(biāo)記基因數(shù)太少,未能覆蓋陸地棉所有染色體,因此連鎖定位成功的幾率極低。

利用目標(biāo)基因組步行PCR[16]、TAIL-PCR[17]、hiTAIL- PCR[18]等結(jié)合全基因組序列對(duì)外源目的基因進(jìn)行測(cè)序定位,從理論上說(shuō)是比較容易獲得特定外源基因插入染色體的精確位置,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因的染色體定位[19]。但實(shí)際上,外源基因?qū)朊藁ㄊ荏w后,其旁側(cè)翼序列會(huì)產(chǎn)生一些不可預(yù)知的DNA 序列結(jié)構(gòu)變化[20]；尤其是陸地棉基因組大而復(fù)雜,不同陸地棉材料的基因序列也不盡相同。因此,盡管在陸地棉中獲得許多轉(zhuǎn)基因事件,但利用測(cè)序方法獲得棉花外源基因準(zhǔn)確定位的公開(kāi)報(bào)道并不多見(jiàn)。比如西南大學(xué)2012年對(duì)外公開(kāi)發(fā)放了中國(guó)轉(zhuǎn)iaaM基因棉花,棉花全基因組測(cè)序結(jié)果也相繼公布[21-22]；但迄今未見(jiàn)iaaM基因被測(cè)序定位的公開(kāi)報(bào)道。這顯示利用TAIL-PCR等方法結(jié)合棉花全基因組序列對(duì)外源目的基因進(jìn)行測(cè)序定位,在實(shí)際應(yīng)用中仍有很大的復(fù)雜性。

董志強(qiáng)等[23]對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉GK-12 的Bt毒蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位試驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的外源晶體毒蛋白取向性定位在細(xì)胞器葉綠體以及前體中。至于Bt基因的染色體定位,肖松華等[24]使用經(jīng)典遺傳學(xué)的方法,試圖對(duì)中國(guó)抗蟲棉GK-12 與美國(guó)抗蟲棉33B 的Bt基因進(jìn)行基因定位,但均未成功。近年來(lái),本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)Guo 等[25]、Zhao 等[26]公布的四倍體棉花分子標(biāo)記遺傳圖譜,并利用自主篩選的相對(duì)均勻分布于棉花26 對(duì)染色體上的234 對(duì)SSR核心引物,已成功對(duì)多個(gè)外源基因進(jìn)行染色體定位[27-29]。這一定位方法是通過(guò)目的基因與特定染色體的多個(gè)SSR 分子標(biāo)記連鎖關(guān)聯(lián)分析,其定位結(jié)果相當(dāng)于多次連鎖重復(fù)驗(yàn)證,具有極高的可靠性。對(duì)于棉花育種的應(yīng)用者來(lái)說(shuō),這種定位結(jié)果可以有效指導(dǎo)育種者根據(jù)孟德?tīng)柕幕颡?dú)立遺傳或連鎖遺傳規(guī)律,依據(jù)育種目標(biāo)來(lái)配置不同的雜交組合,從而有目的地實(shí)現(xiàn)不同外源基因的互補(bǔ)與整合。