馬志宏，黨 巖，茍想珍，張莉敏，劉瑞生

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅 平?jīng)?44000)

紅茂草[dicranostigma leptopodum(Maxim)Fedde]又名禿瘡花,罌粟科(Papaveraceae)紅茂草屬植物,為二年生或多年生草本,有毒[1]。主要含二氫血根堿、6-丙酮基-二氫血根堿、青風(fēng)藤堿、禿瘡花堿、異紫堇堿、紫堇堿、N-甲基蓮葉桐文堿、反式普羅托品季銨鹽、順式普羅托品季銨鹽、原阿片堿和別隱品堿等生物堿[2-3]。許多學(xué)者認(rèn)為紅茂草的有效藥用成分與其所含生物堿有關(guān)[4-10]。但由于生物堿大多難溶甚至不溶于水,這給生物堿的提取利用帶來(lái)不便。本試驗(yàn)利用生物堿的鹽酸鹽易溶于水這一特性,用稀鹽酸溶液進(jìn)行紅茂草總生物堿的提取試驗(yàn),以期為紅茂草的臨床應(yīng)用提供方便。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 紅茂草采自甘肅平?jīng)?自然風(fēng)干,粉碎保存?zhèn)溆谩．愖陷缐A標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自ABCR Gmbh&Co.K G im Schlehert 公司,批號(hào):166401,規(guī)格:10 mg)；乙腈(上海陸忠工貿(mào)有限公司、色譜純)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 Agilent 1100 型高效液相色譜儀由Agilent 公司生產(chǎn)。RE52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀由上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。UV-751GD 型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)由上海分析儀器廠生產(chǎn)。試驗(yàn)所用其他儀器,還有電子分析天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、真空泵等。

1.2 方法

1.2.1 紅茂草總生物堿提取工藝 稱(chēng)取紅茂草粉碎樣品100 g,用稀鹽酸溶液加熱浸提,過(guò)濾得濾液。重復(fù)浸漬3 次,合并濾液,用氨水調(diào)pH 值至8.5 ～9,濾液出現(xiàn)渾濁沉淀,離心,傾出上清液,收集沉淀、干燥,即為紅茂草的總生物堿提取物。用重量法計(jì)算總生物堿的提取率。總生物堿提取率的計(jì)算公式:提取率(%)=最終提取物質(zhì)量/生藥材質(zhì)量×100%

1.2.2 紅茂草總生物堿提取的單因素試驗(yàn) 先分別提取溫度、時(shí)間、pH 值和料液比4 個(gè)單因素對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響,再?gòu)拿總€(gè)單因素中選出3 個(gè)較好水平進(jìn)行正交試驗(yàn),進(jìn)而得出紅茂草總生物堿酸水提取工藝的最佳參數(shù)條件。不同提取時(shí)間對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響:固定料液比1∶30、pH 值為2、作用溫度80 ℃,對(duì)紅茂草粉末按酸水提取工藝分別浸提1 h、2 h、3 h、4 h、5 h,并計(jì)算紅茂草總生物堿的提取率(n=3)。不同料液比對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響:固定作用時(shí)間4 h、pH 值為2、作用溫度80 ℃,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 對(duì)紅茂草粉末按酸水提取工藝進(jìn)行浸提,并計(jì)算紅茂草總生物堿的提取率(n=3)。不同pH 值對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響:固定溫度80 ℃、提取時(shí)間4 h、料液比1∶30,分別用pH 值為1.5、2、2.5、3、3.5 的稀鹽酸溶液按酸水提取工藝進(jìn)行浸提,并計(jì)算紅茂草總生物堿的提取率(n=3)。不同作用溫度對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響:固定作用時(shí)間4 h、pH 值為2、料液比為1∶30,分別以50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90℃按酸水提取工藝進(jìn)行浸提,并計(jì)算紅茂草總生物堿的提取率(n=3)。以上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選用4 因素、3 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)[L9(34)],篩選出紅茂草總生物堿酸水提取法的最佳工藝參數(shù)條件。

1.2.3 HPLC 測(cè)定優(yōu)化條件下紅茂草總生物堿中異紫堇堿含量 按照正交試驗(yàn)所確定的最佳參數(shù)條件進(jìn)行總生物堿的提取,取此少量提取物,用甲醇溶解進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。色譜柱:Zorbax eclipse XDB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相:V乙腈∶V0.03mol/L磷酸二氫鈉=26∶74；流速:1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm；柱溫:30 ℃±1 ℃；進(jìn)樣量:20 μL。

2 結(jié)果

2.1 作用時(shí)間對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響結(jié)果 時(shí)間對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 時(shí)間對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響

從圖1 可以看出,在固定溫度、料液比、pH 值等因素的情況下,紅茂草總生物堿的提取率隨提取時(shí)間的增加而緩慢增加。作用1 h 的提取率為12.38%,作用5 h 的提取率為15.52%。其中作用時(shí)間3 h、4 h、5 h 的提取率波動(dòng)幅度較小,可以考慮用這3 個(gè)作用時(shí)間去提取紅茂草總生物堿。

2.2 料液比對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響結(jié)果 料液比對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響

從圖2 可以看出,在固定作用時(shí)間、溫度、pH 值三因素的情況下,料液比對(duì)紅茂草總生物堿的提取率影響較大。低料液比時(shí),紅茂草總生物堿提取率較低。當(dāng)料液比分別在1∶30、1∶40、1∶50 時(shí),紅茂草總生物堿提取率比較高,且隨著料液比比例的提高,其提取率的變化幅度并不大?？紤]到節(jié)能等因素,生產(chǎn)上可以采用料液比1∶30 的比例進(jìn)行提取。

2.3 pH 值對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3 可以看出,當(dāng)固定溫度、時(shí)間、料液比等因素時(shí),pH 值對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響較大。當(dāng)pH 值為1.5 ～2 時(shí),紅茂草總生物堿的提取率比較高,隨著pH 值的升高,其總生物堿的提取率明顯下降。因此,生產(chǎn)上適合用pH 值為1.5 ～2 的稀鹽酸進(jìn)行紅茂草總生物堿的提取。

圖3 pH 值對(duì)紅茂草總生物堿酸水提取法效果的影響

圖4 溫度對(duì)紅茂草總生物堿酸水提取法效果的影響

2.4 溫度對(duì)紅茂草總生物堿提取率的影響結(jié)果 見(jiàn)圖4。 從圖4 可以看出,當(dāng)固定pH 值、時(shí)間、料液比等因素時(shí),溫度對(duì)紅茂草總生物堿的提取率影響較大。 當(dāng)作用溫度為50 ℃時(shí),提取率為10.18%。當(dāng)溫度升高到90 ℃時(shí),其提取率達(dá)到15.83%。因此紅茂草總生物堿的提取率隨加熱溫度的升高而增加。但當(dāng)溫度達(dá)70 ℃以上時(shí),提取率隨溫度的變化幅度變小?？紤]到節(jié)能環(huán)保等因素,生產(chǎn)上可以考慮用80 ℃去提取紅茂草總生物堿。

2.5 紅茂草總生物堿酸水提取法的正交試驗(yàn)結(jié)果 在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選用4 因素,3水平進(jìn)行正交試驗(yàn),篩選紅茂草酸水提取法的最佳提取條件,具體因素水平見(jiàn)表1。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2 可以看出,影響紅茂草總生物堿提取率因素的主次關(guān)系依次是pH 值(D)、料液比(C)、溫度(A)、時(shí)間(B)。 提取率最高的參數(shù)條件是A3B3C2D1,其次為A2B2C3D1。兩種條件下紅茂草總生物堿的提取率分別達(dá)到16.18%和16.13%。但是A3B3C2D1 工藝參數(shù)與A2B2C3D1 相比,紅茂草總生物堿的提取率相差不大,但是加熱溫度要提高10 ℃,作用時(shí)間要多1 h,考慮到生產(chǎn)中節(jié)能環(huán)保等因素,生產(chǎn)中宜選用A2B2C3D1 參數(shù)條件進(jìn)行紅茂草總生物堿的提取。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

表2 酸水提取法正交試驗(yàn)分析結(jié)果 [L9(34)]

2.6 紅茂草總生物堿中異紫堇堿含量測(cè)定結(jié)果 異紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品及紅茂草總生物堿色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 異紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜分析結(jié)果

圖6 紅茂草總生物堿色譜分析結(jié)果

由圖5、圖6 可知,將異紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品系列的色譜峰面積Y 對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行線性回歸分析,得回歸方程為Y=104 699X+169.57,R2=0.999 7,線性范圍為2.0 ～100.0 μg/mL；異紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間tR的范圍為5.41 ～5.59 min。通過(guò)正交設(shè)計(jì)提取的紅茂草生物堿樣品在5.58 min 時(shí)出峰,峰形對(duì)稱(chēng),與標(biāo)樣接近,經(jīng)計(jì)算其中異紫堇堿含量為9.28%。

使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),可以減少試驗(yàn)次數(shù),較全面地反映各因素水平對(duì)有效成分的提取效果。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)一系列影響因素的考察,確定了紅茂草總生物堿最佳提取工藝模式為:提取溫度90 ℃,提取時(shí)間5 h,料液比1∶40,pH 值1.5。通過(guò)對(duì)紅茂草生物堿正交提取工藝模式的建立研究,為紅茂草生物堿的提取利用提供了依據(jù),拓展了該植物資源新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)思路,為該藥用資源的進(jìn)一步研究提供了可能。