朱曉瑩 孟霄 甘宏濤

摘要：在溫度為15 ℃、pH值為8條件下，測定由初始鹽度2.5%變化至不同鹽度（1.5%、2.0%、3.0%、3.5%）對單環(huán)刺螠非特異性免疫指標（血細胞密度、SOD和ACP活力、MDA含量）的影響。試驗結(jié)果表明，鹽度變化后，血細胞密度在48 h內(nèi)和鹽度呈顯著正相關(guān);各試驗組SOD活力呈先升后降的趨勢，而MDA含量表現(xiàn)為先降后升，且MDA含量與SOD活力呈顯著負相關(guān)（r=-0.969，P<0.05）;ACP活力則呈現(xiàn)2種變化趨勢，鹽度1.5%和2.0%2組先降后升再降，鹽度3.0%和3.5%2組先升后降。至處理96 h，鹽度1.5%和3.5%2組的血細胞密度、SOD和ACP活力顯著低于對照組，而MDA含量顯著高于其他各組（P<0.05）。鹽度2.0%～3.0%為單環(huán)刺螠較適宜的環(huán)境條件，鹽度1.5%和3.5%條件下其免疫力顯著下降，以低鹽環(huán)境影響更為明顯。

關(guān)鍵詞：鹽度變化;單環(huán)刺螠;非特異性免疫;血細胞

中圖分類號： S917? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0197-03

單環(huán)刺螠（Urechis uniconcyus）主要分布于俄羅斯、日本、朝鮮以及我國黃渤海沿岸，是我國沿海存在的唯一無管螠目物種[1]。單環(huán)刺螠肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，其必需氨基酸組成符合人體的吸收比例要求，并富含二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DPA）及Fe、Zn等微量元素，提取物中還有一定的抗腫瘤和提高免疫力作用，因此具有較高的經(jīng)濟價值及良好的開發(fā)利用前景[2]。目前，對單環(huán)刺螠的研究主要集中于纖溶酶的分離純化和溶栓作用提取物的分析、硫化物的應(yīng)激代謝以及人工繁育等方面[3-5]，而有關(guān)環(huán)境因子對單環(huán)刺螠免疫功能影響的報道相對較少。本研究觀察了不同鹽度條件下單環(huán)刺螠免疫相關(guān)指標的變化，旨在探討單環(huán)刺螠對鹽度的生理調(diào)節(jié)機制，為人工養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

單環(huán)刺螠體長（15.1±1.5） cm、體質(zhì)量（31.2±4.2） g，于2017年4月購自江蘇省連云港市水產(chǎn)品市場，采用循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)條件為：鹽度2.5%，pH值=8，水溫 15 ℃，自然光照，連續(xù)充氣，日投喂2次藻液。選擇大小相近、體表無損傷且活力強者用于試驗。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗初始鹽度為2.5%，設(shè)對照組為2.5%，試驗組分別為1.5%、2.0%、3.0%、3.5%。并采用曝氣自來水和海水晶配制所需鹽度的人工海水，pH值為8。每組設(shè)3個平行，每個平行隨機放20條單環(huán)刺螠，于40 cm×30 cm×30 cm水族缸中飼養(yǎng)，水溫、餌料、充氣等養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時相同。每天定時換水1次，每次換水50%。每個平行分別于6、12、24、48、72、96 h取3條單環(huán)刺螠，用蒸餾水沖洗，濾紙吸干體表水分，進行解剖并取其血液，保留部分全血用于測定血細胞密度，另一部分于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液血清，于-80 ℃保存，進行測定其他免疫相關(guān)指標。

1.3 檢測方法

用血球計數(shù)板計算血細胞密度，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力采用連苯三酚自氧化法測定[6]，酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和樣品蛋白含量參考南京建成生物工程研究所試劑盒說明進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 18.0軟件進行單因子方差分析，LSD多重比較和Duncans檢驗，顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度變化對單環(huán)刺螠血細胞密度的影響

由圖1可知，處理6 h時，各組血細胞密度和鹽度呈顯著正相關(guān)（r2=0.955，P<0.05），以鹽度1.5%組血細胞密度（1.20×108個/mL）最低，僅為鹽度3.5%組的67%。處理12 h時，各試驗組血細胞密度均有所上升，以鹽度3.0%、3.5%組升高幅度較大，并顯著高于鹽度2.5%組，而鹽度1.5%組血細胞密度雖有所回升，但仍顯著低于其他各組（P<0.05）。隨處理時間的延長，鹽度1.5%、3.0%、3.5%組血細胞密度呈現(xiàn)下降趨勢，至處理48 h時，各組血細胞密度和鹽度仍呈顯著正相關(guān)（r=0.987，P<0.05）。處理96 h后，以鹽度1.5%組血細胞密度最低，鹽度3.5%組次之，而鹽度2.0%、2.5%、3.0%組的血細胞密度組間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 鹽度變化對單環(huán)刺螠SOD活力的影響

由圖2可知，鹽度變化對單環(huán)刺螠SOD活力的影響顯著。除鹽度2.5%組SOD活力略有波動外，其他組均呈先升后降趨勢。處理6 h，鹽度3.5%組SOD活力顯著高于其他組，處理 48 h 后升至最高值，隨后下降。鹽度1.5%和2.0% 2組SOD活力上升幅度較小，于處理24 h升至最高。鹽度3.0%組SOD活力在處理6 h時無明顯變化，隨著處理時間延長亦逐漸升高，至處理48 h升至最高，且上升幅度最大。處理96 h后，鹽度1.5%和3.5% 2組SOD活力顯著低于其他試驗組（P<0.05），較鹽度2.5%組分別下降54.53%和45.65%。

2.3 鹽度變化對單環(huán)刺螠MDA含量的影響

由圖3可知，鹽度變化后各試驗組MDA含量均呈先降后升的趨勢，以鹽度3.5%組MDA含量下降最為明顯。鹽度1.5%和3.5% 2組、鹽度2.0%和3.0%2組分別于處理24、48 h時降至最低，隨后逐漸上升。至處理96 h，以鹽度1.5%組MDA含量最高，鹽度3.5%組次之，其他3個試驗組間相近（P>0.05），且MDA含量與SOD活力呈顯著負相關(guān)（r=-0.969，P<0.05）。

2.4 鹽度變化對單環(huán)刺螠ACP活力的影響

由圖4可知，鹽度變化后，單環(huán)刺螠ACP活力呈現(xiàn)2種變化趨勢，由初始鹽度2.5%下降至1.5%和2.0%，ACP活力呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢;而由鹽度2.5%升高至3.0%和3.5%，ACP活力則呈現(xiàn)先升后降趨勢。鹽度1.5%和2.0%2組在處理6 h后，ACP活力顯著低于對照組，隨后回升，至處理24 h后升至最高值后下降。鹽度3.0%組和3.5%組ACP活力分別處理72、48 h后升至最高，以鹽度3.0%組上升幅度最大。處理96 h后，以鹽度3.0%組ACP活力最高，鹽度1.5%和3.5%2組顯著低于對照組（P<0.05）。

3 討論

3.1 鹽度變化對單環(huán)刺螠血細胞密度的影響

無脊椎動物血細胞是其免疫功能的主要實施者，血細胞在發(fā)揮吞噬功能時還會釋放一些免疫因子，與血淋巴中的其他免疫因子互相協(xié)同以抵御外來病原對機體的侵害[7]。據(jù)報道，鹽度變化對血細胞有顯著影響，降低和升高都會導致血細胞減少，而低鹽度條件下血細胞減少更為顯著[8-9]。但

Reid等研究發(fā)現(xiàn)，鹽度在2.0%～4.0%范圍內(nèi)，菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）血細胞密度在鹽度為2.0%時減少，在鹽度為4.0%時顯著增多[10]。本結(jié)果表明，鹽度變化對單環(huán)刺螠血細胞密度有顯著影響，短期內(nèi)高鹽度3.5%組單環(huán)刺螠血細胞密度顯著增多，這與Reid等的高鹽度脅迫下血細胞密度顯著增多的研究結(jié)果[10]一致。隨著處理時間的延長，鹽度2.0%、2.5%和3.0%組的血細胞密度無顯著差異，但鹽度1.5%和3.5%2組血細胞密度顯著低于其他試驗組，與Zhao等對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的研究結(jié)果[11]相近。在處理6～48 h，單環(huán)刺螠的血細胞密度和鹽度呈顯著正相關(guān)，這可能由于鹽度變化后，機體處于低滲或高滲環(huán)境中，為調(diào)整體內(nèi)外滲透壓的平衡而導致血細胞密度變化。長時間脅迫下，鹽度15和35兩組血細胞密度顯著降低，表明單環(huán)刺螠處于不適宜鹽度環(huán)境下其免疫力受到較大的影響。

3.2 鹽度變化對單環(huán)刺螠SOD活力和MDA含量的影響

生物體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生活性氧自由基，對機體可造成氧化損傷，而SOD可以清除過量的自由基，對保護機體免受自由基損害起著重要作用[12]。Wang等將鹽度由2.5%變化至0.5%、1.5%和3.5%后96 h，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）血液SOD活力分別下降52%、27%和24%[13]。鄭慧等研究發(fā)現(xiàn)，鹽度變化會引起刺參（Apostichopus japonicus）體腔液SOD活力降低[14]。本研究結(jié)果表明，鹽度的升高或降低都會使單環(huán)刺螠SOD活力呈先升后降的趨勢，表明機體在遭遇鹽度突變時，會引發(fā)一系列生理應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過量的氧自由基，誘發(fā)SOD活性增強，以降低鹽度突變對機體的氧化損傷，增強免疫能力和對鹽度突變的耐受能力，與高杉等對大竹蟶（Solen grandis）的研究結(jié)果[15]一致。鹽度變化96 h后，鹽度變化幅度較大的15和35兩組SOD活力顯著下降，表明機體的滲透調(diào)節(jié)負擔過重會導致其抗氧化系統(tǒng)受損，尤以低鹽的影響更為顯著。

MDA是生物膜中多不飽和脂肪酸在活性氧自由基攻擊下而引發(fā)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量能夠直接反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的強度和速率，可廣泛用于氧化應(yīng)激中自由基產(chǎn)生和生物膜氧化損傷程度的評價指標[16]。季延濱等將革胡子鲇（Claries lazera）的水體鹽度升高96 h后，其血清MDA含量顯著升高[17]。鹽度變化后單環(huán)刺螠MDA含量均呈先降后升的趨勢，以鹽度1.5%和3.5%2組變化幅度較大，表明低鹽度短時間的鹽脅迫能引起機體應(yīng)激反應(yīng)，適當提高其免疫力，而長時間高鹽度變化會造成較大的氧化損傷。本研究中MDA含量與SOD活力呈顯著負相關(guān)，故可將SOD活力和MDA含量的長期變化用于評價鹽度變化下單環(huán)刺螠的免疫狀態(tài)。

3.3 鹽度變化對單環(huán)刺螠ACP活力的影響

ACP是在酸性條件下，催化磷酸單酯水解的酶為溶酶體的標志酶，在溶酶體發(fā)揮正常生理功能及機體免疫中起重要作用[18]。印度明對蝦（Fenneropenaeus indicus）在鹽度變化后其ACP活力均呈先升后降的趨勢，于72 h升至最高[19]。在鹽度2.5%、3.5%、4.0%下，刺參體腔液ACP活力于10 d達到最高值后下降[14]。本研究中，由鹽度2.5%升高至3.0%、3.5%，單環(huán)刺螠ACP活力先升后降，與上述研究結(jié)果相近。鹽度3.0%組ACP活力升高幅度最大，且處理96 h后仍然顯著高于鹽度2.5%組，表明適當?shù)柠}度變化可刺激機體的免疫力有所提高。而由初始鹽度2.5%下降至1.5%和2.0%，單環(huán)刺螠ACP活力表現(xiàn)為先下降，表明機體處在低鹽環(huán)境下，進行滲透壓調(diào)節(jié)需要消耗更多能量從而影響其免疫力。鹽度變化96 h后，鹽度2.0%組ACP活力與鹽度2.5%組相近，表明適當?shù)柠}度下降后，機體通過一段時間調(diào)整可達到新的滲透平衡;而鹽度1.5%和3.5%2組ACP活力顯著低于對照組，表明過低和過高的鹽度都會對機體免疫力產(chǎn)生不利影響。

綜上所述，鹽度變化對單環(huán)刺螠非特異性免疫有較大影響，鹽度2.0%～3.0%為單環(huán)刺螠較適宜的環(huán)境條件，鹽度1.5%和3.5%條件下其免疫力顯著下降，以低鹽環(huán)境下影響更為明顯。在適當范圍內(nèi)，機體可通過自身的調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境中的鹽度變化，但鹽度的變化幅度較大會使機體的生理機能遭受脅迫，免疫力下降，可能引起疾病暴發(fā)。因此，在單環(huán)刺螠的養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水環(huán)境的鹽度變化不容忽視，尤其是連續(xù)降雨造成養(yǎng)殖水體的鹽度急劇下降時要注意及時換水。

參考文獻：

[1]李 諾，宋淑蓮，唐永政. 單環(huán)刺螠[J]. 生物學通報，1998（8）：13-15.

[2]劉海梅，王苗苗，趙 芹. 單環(huán)刺螠體壁肌酶解產(chǎn)物的營養(yǎng)評價及其溶解性分析[J]. 食品與機械，2016（5）：20-23.

[3]蔣仲青，劉萬順，韓寶芹，等. 單環(huán)刺螠纖溶酶的分離純化及溶栓活性的初步研究[J]. 中國海洋大學學報（自然科學版），2009，39（增刊1）：138-142.

[4]Ma X Y，Liu X L，Zhou D，et al. The NF-kappa B pathway participates in the response to sulfide stress in Urechis unicinctus[J]. Fish & Shellfish Immunology，2016，58：229-238.

[5]許星鴻，霍 偉，孟 霄，等. 單環(huán)刺螠人工育苗及養(yǎng)殖技術(shù)[J]. 科學養(yǎng)魚，2016（2）：44-45.

[6]高繼國，郭春絨. 普通生物化學教程實驗指導[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2009：105-108.

[7]劉雪蘭，余為一. 甲殼動物免疫因子的研究進展[J]. 水生生物學報，2003，27（4）：418-421.

[8]Lin Y C，Chen J C，Li C C，et al. Modulation of the innate immune system in white shrimp Litopenaeus vannamei following long-term low salinity exposure[J]. Fish & Shellfish Immunology，2012，33（2）：324-331.

[9]de Zoysa M，Whang I，Lee Y，et al. Transcriptional analysis of antioxidant and immune defense genes in disk abalone （Haliotis discus discus） during thermal，low-salinity and hypoxic stress[J]. Comparative Biochemistry and Physiology，2009，154（4）：387-395.

[10]Reid H I，Soudant P，Lambert C，et al. Salinity effects on immune parameters of Ruditapes philippinarum challenged with Vibrio tapetis[J]. Diseases of Aquatic Organisms，2003，56（3）：249-258.

[11]Zhao Q，Pan L，Ren Q，et al. Effect of salinity on regulation mechanism of neuroendocrine-immunoregulatory network in Litopenaeus vannamei[J]. Fish & Shellfish Immunology，2016，49：396-406.

[12]Halliwell B，Gutteridge J C. Free radical in biology and medicine[M]. 2nd ed. Oxford：Clarendon Press，1989.

[13]Wang F I，Chen J C. Effect of salinity on the immune response of tiger shrimp Penaeus monodon and its susceptibility to Photobacterium damselae subsp. damselae[J]. Fish & Shellfish Immunology，2006，20（5）：671-681.

[14]鄭 慧，李 彬，榮小軍，等. 鹽度和溶解氧對刺參（Apostichopus japonicus）非特異性免疫酶活性的影響[J]. 漁業(yè)科學進展，2014，35（1）：118-124.

[15]高 杉，周遵春，董 穎，等. 鹽度及pH突變對大竹蟶稚貝抗氧化酶活力的影響[J]. 大連海洋大學學報，2017，32（1）：62-67.

[16]Lepage G，Munoz G，Champagne J，et al. Preparative steps necessary for the accurate measurement of malondialdehyde by high-performance liquid -chrmatography[J]. Analytical Biochemistry，1991，197（2）：277-283.

[17]季延濱，孫學亮，陳成勛. 鹽度對革胡子鲇部分抗氧化指標的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（8）：233-235.

[18]翟中和. 細胞生物學[M]. 4版.北京：高等教育出版社，2011：130-134.

[19]Vaseeharan B，Ramasamy P，Wesley S G，et al. Influence of acute salinity changes on biochemical，hematological and immune characteristics of Fenneropenaeus indicus during white spot syndrome virus challenge[J]. Microbiology Immunology，2013，57（6）：463-469.