李衛(wèi)泊尹昱 梁傳棟 呂佩源 趙振彪 董長征

目前認(rèn)為，興奮性遞質(zhì)與抑制性遞質(zhì)失衡是癲癇的發(fā)病機(jī)理之一。N-甲基-D-天氡氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體作為一種重要的興奮性氨基酸受體，因可介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流引起神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性損傷，在癲癇發(fā)病和腦損傷機(jī)制中起著重要作用[1]。伽瑪?shù)蹲鳛椴婚_顱治療顱內(nèi)病變的重要手段，已用于難治性癲癇的治療，但確切的生物學(xué)機(jī)制尚不明確。本研究旨在觀察低劑量伽瑪?shù)墩丈浜蟀d癇大鼠皮層及海馬NMDA受體亞基NR1、NR2A和NR2B的表達(dá)變化，以期探討伽瑪?shù)吨委煱d癇的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與癲癇模型制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性Wistar大鼠，根據(jù)動(dòng)物是否應(yīng)用藥物戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）致癇及接受伽瑪?shù)墩丈洌瑢?0只大鼠隨機(jī)分為4組，每組各15只：①對照組；②伽瑪?shù)督M：大鼠單純接受伽瑪?shù)墩丈洌恢掳B；③藥物致癇組：大鼠經(jīng)腹腔注射PTZ致癇；④伽瑪?shù)?藥物組：PTZ致癇大鼠再經(jīng)伽瑪?shù)墩丈洹４笫蟀?5 mg/kg經(jīng)腹腔注射PTZ溶液制備癲癇模型，每24 h注射1次，連續(xù)注射4周，非致癇組大鼠腹腔注射同等容量相同次數(shù)的生理鹽水。

大鼠癇性發(fā)作嚴(yán)重程度采用修正Racine六級評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)[2]，每次注射后觀察并記錄各組大鼠出現(xiàn)癇性發(fā)作的強(qiáng)度。在PTZ連續(xù)注射期間內(nèi)至少出現(xiàn)連續(xù)3次的Ⅳ級以上的癇性發(fā)作視為完全點(diǎn)燃，只有完全點(diǎn)燃的大鼠用于后續(xù)的研究，此后仍每周腹腔注射1次相同劑量的PTZ以維持發(fā)作。

實(shí)驗(yàn)大鼠于注射PTZ 3～6次后出現(xiàn)癇性發(fā)作，如眨眼、節(jié)律性咀嚼、點(diǎn)頭、甩尾、前肢陣攣、全身肌陣攣、跌倒等表現(xiàn)，每次于注射后3～5 min出現(xiàn)，每次發(fā)作持續(xù)約40～60 min后逐漸緩解。24只大鼠于注射12～16次后達(dá)到完全點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，癲癇模型制備成功率為80%。其余6只在PTZ連續(xù)注射期間內(nèi)未達(dá)到完全點(diǎn)燃，將其剔除出后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2 低劑量伽瑪?shù)墩丈溆赑TZ連續(xù)注射4周，癲癇模型制備成功后，應(yīng)用Leksell伽瑪?shù)断到y(tǒng)（ELEKTA，瑞典）對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行低劑量伽瑪?shù)墩丈洌瑢⒋笫舐樽砗笾糜趧?dòng)物固定架及伽瑪?shù)兜腖eksell框架上，通過核磁共振儀（GE，Signa1.5T）對大鼠進(jìn)行腦冠狀面連續(xù)定位掃描，以大鼠雙側(cè)額葉為照射靶區(qū)，并根據(jù)核磁圖像在Gamma Plan系統(tǒng)上確定雙側(cè)額葉的坐標(biāo)軸，然后按所定坐標(biāo)將動(dòng)物固定架安放在伽瑪?shù)抖ㄎ患苌?，?0%等劑量曲線包裹靶區(qū)，邊緣劑量為15 Gy，用4 mm準(zhǔn)直器對大鼠腦組織進(jìn)行照射[3]。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠于伽瑪?shù)墩丈浜?2周（對照組8只，伽瑪?shù)督M8只，藥物致癇組6只，伽瑪?shù)?藥物組6只），常規(guī)灌注取腦、包埋、切片，采用SP法進(jìn)行免疫組化染色。每組選取對應(yīng)斷面的腦切片，光鏡下觀察額葉皮層和海馬區(qū)域NR1、NR2A、NR2B 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞（NR1、NMDAR2A及NMDAR2B單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司）的形態(tài)和分布，利用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析，分別計(jì)算額葉和海馬CA1和CA3區(qū)相同面積內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，并對陽性細(xì)胞進(jìn)行平均吸光度值測定。

1.4 蛋白免疫印跡檢測各組大鼠分別于伽瑪?shù)墩丈浜?2周（對照組7只，伽瑪?shù)督M7只，藥物致癇組6只，伽瑪?shù)?藥物組6只），常規(guī)斷頭取腦，留取額葉皮層及海馬組織，提取總蛋白，-80℃保存?zhèn)溆?。通過蛋白免疫印跡法檢測NMDA受體亞基 NR1、NR2A、NR2B 的蛋白表達(dá)情況（NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B單克隆抗體及β-Actin多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司）。應(yīng)用BAND SCAN圖像分析軟件對蛋白電泳條帶的灰度值進(jìn)行測定，將各目標(biāo)條帶與內(nèi)參照β-actin條帶進(jìn)行灰度比較，進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK法；非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)及癲癇發(fā)作觀察對照組及伽瑪?shù)督M大鼠無癇性發(fā)作表現(xiàn)，行為正常。藥物致癇組大鼠點(diǎn)燃后每周再次注射PTZ后，絕大部分可出現(xiàn)Ⅳ級以上發(fā)作。伽瑪?shù)?藥物組大鼠經(jīng)低劑量伽瑪?shù)墩丈浜?，隨觀察時(shí)間的延長，與藥物致癇組相比，每周再次注射PTZ，發(fā)作程度逐漸減輕，于照射后12周時(shí)，發(fā)作癥狀明顯減輕 （Z=-2.27，P＜0.05，表 1）。

2.2 大鼠額葉及海馬NR1、NR2A、NR2B免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元觀察大鼠額葉皮層及海馬區(qū)域均可見散在分布的 NR1、NR2A、NR2B免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元，其中對照組及伽瑪?shù)督M在額葉皮層及海馬 CA1、CA3 區(qū)，NR1、NR2A、NR2B 陽性神經(jīng)元胞漿呈棕黃色，胞體較大，可見突起。而藥物致癇組皮層及海馬 CA1、CA3 區(qū) NR1、NR2A、NR2B 免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多 （NR1：F額葉＝10.47，F(xiàn)CA1＝12.75，F(xiàn)CA3＝16.93；NR2A：F額葉＝13.40，F(xiàn)CA1＝10.56，F(xiàn)CA3＝18.28；NR2B：F額葉＝11.26，F(xiàn)CA1＝10.09，F(xiàn)CA3＝8.44；P＜0.05），胞漿染色較深，樹突減少、甚至消失，平均吸光度值均明顯增加（NR1：F額葉＝25.02，F(xiàn)CA1＝7.27，F(xiàn)CA3＝10.71；NR2A：F額葉＝16.62，F(xiàn)CA1＝9.10，F(xiàn)CA3＝30.39；NR2B：F額葉＝11.96，F(xiàn)CA1＝14.28，F(xiàn)CA3＝32.56；P＜0.05）。伽瑪?shù)?藥物組反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目及形態(tài)接近對照組 （圖1～3和表 2～4）。

圖1 NR1在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達(dá)情況（IHC，×400）。（A）對照組；（B）伽瑪?shù)督M；（C）藥物致癇組；（D）伽瑪?shù)?藥物組

2.3 大鼠額葉及海馬NMDAR亞基免疫蛋白印跡結(jié)果結(jié)果顯示，與對照組比較，藥物致癇組大鼠額葉皮層及海馬NR1、NR2A和NR2B表達(dá)均明顯增強(qiáng)；與藥物致癇組比較，伽瑪?shù)?藥物組額葉皮層及海馬NR1、NR2A和NR2B表達(dá)均明顯減少（NR1：F額葉＝35.60，F(xiàn)海馬＝19.68；NR2A：F額葉＝44.39，F(xiàn)海馬＝39.31；NR2B：F額葉＝50.26，F(xiàn)海馬＝47.70；P＜0.05），伽瑪?shù)杜c對照組無明顯差別（圖 4及表 5）。

表1 兩組大鼠癇性發(fā)作程度（只）

3 討論

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)快速興奮性突觸反應(yīng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其受體分為離子型和代謝型兩大類，其中離子型的NMDA受體主要分布于大腦皮層、海馬、丘腦、紋狀體、小腦及腦干的突觸后膜上，是由NR1、NR2和NR3不同亞單位組成的異聚體。NR1亞基是基本功能亞單位，NR2、NR3亞基為調(diào)節(jié)亞單位，其中NR2有NR2A、NR2B、NR2C、NR2D亞型，在很大程度上決定了該受體的性質(zhì)。研究表明，NMDA受體的激活是維持神經(jīng)系統(tǒng)正?；顒?dòng)的前提，在突觸傳遞和神經(jīng)可塑性等生理過程中扮演關(guān)鍵角色，而NMDA受體過度的激活則可能與多種病理過程密切相關(guān)[3]。越來越多的資料顯示，NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性在癲癇的發(fā)病過程中起重要的作用[4]。NMDA受體拮抗劑不但可以阻止癲癇的產(chǎn)生，還可以抑制由于癲癇而導(dǎo)致的大腦結(jié)構(gòu)的改變[5]。此外，NMDA受體被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵物質(zhì)，LTP的產(chǎn)生依賴于突觸前膜谷氨酸等興奮性遞質(zhì)的釋放和突觸后膜NMDA受體的激活。近年研究發(fā)現(xiàn)，NMDA受體可能在認(rèn)知功能中具有雙向作用，并與癲癇后認(rèn)知功能損害有關(guān)。

圖2 NR2A在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達(dá)情況（IHC，×400）。 （A）對照組;（B）伽瑪?shù)督M;（C）藥物致癇組;（D）伽瑪?shù)?藥物組

圖3 NR2B在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達(dá)情況（IHC，×400）。（A）對照組；（B）伽瑪?shù)督M；（C）藥物致癇組；（D）伽瑪?shù)?藥物組

圖4 NR1，NR2A和NR2B在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達(dá)（免疫蛋白印跡法，β-actin為內(nèi)參蛋白）。（A）對照組；（B）伽瑪?shù)督M；（C）藥物致癇組；（D）伽瑪?shù)?藥物組

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，癲癇大鼠額葉皮層及海馬區(qū)域NMDA受體亞基NR1、NR2A及NR2B蛋白表達(dá)均顯著升高。課題組前期基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)癲癇發(fā)作可導(dǎo)致廣泛的認(rèn)知功能障礙[6-7]，因此，本研究提示，PTZ誘發(fā)癲癇的機(jī)制可能與PTZ提高腦組織 NR1、NR2A及NR2B亞單位蛋白的過度表達(dá)而改變NMDA受體的功能有關(guān)，而NMDA受體功能的變化可能是導(dǎo)致癲癇后出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的原因之一。

表2 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區(qū)NR1免疫陽性神經(jīng)元數(shù)及平均吸光度值（±s）

表2 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區(qū)NR1免疫陽性神經(jīng)元數(shù)及平均吸光度值（±s）

1） 與對照組比較，P＜0.05；2）與藥物致癇組比較，P＜0.05

組別n對照組伽瑪?shù)端幬镏掳B組伽瑪?shù)叮幬锝M8 8 6 6額葉1 3.7 5±3.2 8 1 4.1 3±2.6 4 2 2.3 3±3.2 7 1)1 7.6 7±3.6 1 2)免疫陽性神經(jīng)元數(shù)C A 1 1 9.7 5±3.3 7 2 0.1 2±3.2 7 2 9.5 0±2.5 9 1)2 3.5 0±3.6 2 2)C A 2 1 7.6 2±3.6 7 1 8.6 3±2.9 7 2 9.1 7±3.1 9 1)2 1.6 7±3.0 8 2)額葉0.2 1±0.0 3 0.2 2±0.0 3 0.3 3±0.0 3 1)0.2 5±0.0 3 2)平均吸光度值C A 1 0.3 2±0.0 4 0.3 1±0.0 4 0.4 1±0.0 5 1)0.3 4±0.0 3 2)C A 2 0.2 7±0.0 5 0.2 8±0.0 4 0.3 9±0.0 4 1)0.3 0±0.0 4 2)

表3 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區(qū)NR2A免疫陽性神經(jīng)元數(shù)及平均吸光度值（±s）

表3 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區(qū)NR2A免疫陽性神經(jīng)元數(shù)及平均吸光度值（±s）

1） 與對照組比較，P＜0.05；2）與藥物致癇組比較，P＜0.05

組別n對照組伽瑪?shù)端幬镏掳B組伽瑪?shù)叮幬锝M8 8 6 6額葉1 2.7 5±2.9 6 1 3.3 8±2.8 3 2 1.8 3±3.1 3 1)1 6.3 3±2.7 3 2)免疫陽性神經(jīng)元數(shù)C A 1 1 4.5 0±3.2 1 1 5.6 2±2.8 8 2 3.3 3±2.7 3 1)1 7.6 7±3.5 6 2)C A 3 1 2.6 2±2.8 3 1 4.2 5±4.7 7 2 5.3 3±3.5 6 1)2 1.8 3±3.1 9 2)額葉0.2 0±0.0 3 0.2 1±0.0 3 0.3 2±0.0 4 1)0.2 4±0.0 4 2)平均吸光度值C A 1 0.2 5±0.0 5 0.2 7±0.0 4 0.3 7±0.0 5 1)0.3 0±0.0 4 2)C A 3 0.2 2±0.0 3 0.2 3±0.0 4 0.3 8±0.0 4 1)0.2 7±0.0 3 2)

表4 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區(qū)NR2B免疫陽性神經(jīng)元數(shù)及平均吸光度值（±s）

表4 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區(qū)NR2B免疫陽性神經(jīng)元數(shù)及平均吸光度值（±s）

1） 與對照組比較，P＜0.05；2）與藥物致癇組比較，P＜0.05

組別n對照組伽瑪?shù)端幬镏掳B組伽瑪?shù)叮幬锝M8 8 6 6額葉1 3.5 0±3.0 7 1 4.7 5±3.2 8 2 2.5 0±2.5 9 1)1 7.1 7±3.1 3 2)免疫陽性神經(jīng)元數(shù)C A 1 1 6.7 5±2.9 2 1 6.5 0±2.6 2 2 5.1 7±3.5 4 1)1 9.5 0±4.0 9 2)C A 2 1 4.2 5±3.1 1 1 5.7 5±3.8 8 2 4.1 7±4.8 8 1)1 8.3 3±3.6 7 2)額葉0.2 1±0.0 4 0.2 2±0.0 3 0.3 3±0.0 6 1)0.2 5±0.0 4 2)平均吸光度值C A 1 0.2 3±0.0 4 0.2 4±0.0 4 0.3 6±0.0 6 1)0.2 8±0.0 3 2)C A 2 0.2 0±0.0 2 0.1 9±0.0 3 0.3 5±0.0 5 1)0.2 3±0.0 4 2)

表5 免疫蛋白印跡法檢測NR1,NR2A和 NR2B在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達(dá)（±s）

表5 免疫蛋白印跡法檢測NR1,NR2A和 NR2B在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達(dá)（±s）

1） 與對照組比較，P＜0.05；2）與藥物致癇組比較，P＜0.05

組別n N R 1 N R 2 A N R 2 B對照組伽瑪?shù)端幬镏掳B組伽瑪?shù)叮幬锝M7 7 6 6額葉0.6 8±0.1 0 0.6 4±0.0 6 1.2 6±0.1 5 1)0.7 8±0.1 6 2)海馬0.8 5±0.1 0 0.9 1±0.0 9 1.4 2±0.2 5 1)1.1 5±0.1 2 2)額葉0.5 5±0.1 0 0.6 1±0.1 1 1.2 3±0.1 2 1)0.7 2±0.1 3 2)海馬0.7 3±0.0 9 0.7 2±0.0 7 1.3 5±0.1 5 1)0.8 1±0.1 5 2)額葉0.6 3±0.0 5 0.7 5±0.0 8 1.3 7±0.1 9 1)0.9 1±0.1 1 2)海馬0.8 7±0.0 9 0.8 1±0.0 8 1.4 5±0.1 1 1)1.0 2±0.1 4 2)

自上世紀(jì)中葉Leksell提出放射神經(jīng)外科的概念以來，伽瑪?shù)吨饾u成為不開顱治療顱內(nèi)病變的重要手段，具有安全，定位精確，對周圍組織損傷小等優(yōu)點(diǎn)，已用于難治性癲癇的治療，但目前伽瑪?shù)犊拱B的作用機(jī)制仍不十分清楚，限制了治療的進(jìn)一步優(yōu)化。有研究表明[8]，低劑量伽瑪?shù)墩丈渲委煱d癇的機(jī)制可能與增加致癇灶抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的含量，減輕癲癇發(fā)作后的氧化應(yīng)激損傷以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)；還有學(xué)者認(rèn)為，低劑量伽瑪?shù)犊勺铚d癇神經(jīng)元的突觸傳導(dǎo)，降低癲癇神經(jīng)元自身活性而不會引起正常神經(jīng)元壞死，從而使癲癇發(fā)作得到有效控制。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠經(jīng)邊緣劑量15Gy的低劑量伽瑪?shù)墩丈浜?，癇性發(fā)作明顯減少，且伴有額葉皮層和海馬NR1、NR2A和NR2B表達(dá)降低。同時(shí)，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠經(jīng)低劑量伽瑪?shù)墩丈浜?，認(rèn)知功能也得以改善，提示NMDA受體亞基的表達(dá)變化在低劑量伽瑪?shù)犊拱d癇治療和改善認(rèn)知功能的過程中可能發(fā)揮了重要作用，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。