王慧,席小麗

(1.山西大學 分子科學研究所,山西 太原 030006;2.太原科技大學 化學與生物工程學院,山西 太原 030024)

0 引言

復(fù)方雙黃連是由金銀花、黃芩、連翹三味藥材組成的復(fù)方制劑,主要用于治療風熱感冒發(fā)熱、肺炎、呼吸道感染、扁桃體炎等疾病[1-2],對呼吸道感染及病毒性疾病有確切的療效。

目前,復(fù)方雙黃連有效成分的提取方法主要是傳統(tǒng)的水提法,中華人民共和國藥典方法(2015年版)需要對藥物原料多次煎煮、反復(fù)浸提并多次過濾,操作工藝復(fù)雜,成本較高,生產(chǎn)周期較長。因此,為了進一步探討更加經(jīng)濟綠色的提取技術(shù),相關(guān)學者開始致力于研究超高壓技術(shù)以及采用低共熔溶劑等新型溶劑應(yīng)用于中藥成分的提取。超高壓提取技術(shù)(UPE)是最近幾年才出現(xiàn)的一種全新的常溫提取技術(shù)[3],超高壓提取溫度較低,有利于復(fù)方雙黃連熱敏感程度成分綠原酸和連翹苷的提取。

低共熔溶劑(Deep eutectic solvents,DESs) 是由2種或2種以上組分組成的低共熔體系,它有許多獨特的性質(zhì),如較低的熔點,較高的表面張力,低的蒸汽壓,相對高的熱穩(wěn)定性，良好的擴散速度,以及優(yōu)良的溶解性，可溶解多種無機物質(zhì)及難溶的有機物等。由于DESs 獨特的理化性質(zhì),目前在中藥提取、分離和分析等方面得到了廣泛的應(yīng)用,很多研究人員用低共熔溶劑來提取和分離天然產(chǎn)物中酚類、黃酮類、萜烯類、多糖、蛋白質(zhì)等不同極性的化合物,并且取得了良好的效果[4-6]。氯化膽堿(Choline Chloride,ChCl)是動物生長不可缺少的一種水溶性維生素,在動物體內(nèi)起著極其重要的作用,現(xiàn)已成為人類食品和動物飼料中的常用添加劑。乳酸(Lactic Acid,LA)是一種天然有機酸,由于酸性柔和且性質(zhì)穩(wěn)定,美國FDA將其確認為安全優(yōu)良的防腐劑和腌漬劑,用于清涼飲料、糖果、糕點的生產(chǎn)當中。另外,乳酸水溶液還可以延長禽肉和魚肉的保質(zhì)期。前期的研究證明,用ChCl-LA作為溶劑提取黃芩苷達到了理想的效果[7]。另外據(jù)文獻[8]報道組成DESs的單個成分無毒,則 DESs也無毒。

本文以ChCl-LA作為提取溶劑,結(jié)合超高壓方法提取復(fù)方雙黃連的3種有效成分;依據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取低共熔溶劑含水量、固液比、提取壓力、提取時間4個因素,并且采用正交實驗法優(yōu)化了復(fù)方雙黃連3種有效成分的提取條件;同時和藥典提取方法進行對比。

1 實驗部分

1.1 儀器和材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司);HLM-100-300S食品高壓加工機(山西三水銀河科技有限公司);Sarturius.BS110S分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);HH4恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠)。

黃芩飲片(批號:1712035;規(guī)格:0.5 kg/袋)、連翹飲片(批號:1812071;規(guī)格:0.5 kg/袋)、金銀花飲片(批號:1809004;規(guī)格:0.5 kg/袋)均購于安國市遠光藥業(yè)有限公司,均符合《中國藥典》2015年版規(guī)定。黃芩苷標準品(批號:331C021)、綠原酸標準品(批號:516E021)、連翹苷標準品(批號:226A023)均由北京索萊寶科技有限公司提供,純度均>98%;色譜甲醇(賽默飛世爾科技有限公司);所用水均為純凈水;其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 DESs的合成和DESs水溶液制備

DESs的合成:將氯化膽堿與乳酸以摩爾比1∶1的比例混合放置在圓底燒瓶中,用磁力攪拌器90℃攪拌10 h左右,直至形成均一穩(wěn)定的透明體系。待冷卻至室溫后,將所得DESs密封置于干燥器中以P2O5干燥至少14 d,備用。

DESs水溶液制備: 按照體積分數(shù)配制一定含水量(10%、20%、30%、40%、50%)的低共熔水溶液,充分搖勻、靜置,得到均一、透明的低共熔水溶液。

1.2.2 樣品提取

取黃芩飲片、連翹飲片、金銀花飲片粉碎,過60目篩,稱取黃芩(0.125 g),連翹(0.25 g),金銀花(0.125 g),加入4 mL低共熔溶劑(ChCl-LA,摩爾比1∶1)混合置于聚乙烯袋(PE)內(nèi)抽真空密封,將上述封裝好的樣品放入超高壓設(shè)備中,設(shè)置提取條件(提取壓力為400 MPa,提取時間為4 min)。提取完畢后,對其進行離心過濾,按照1.2.3.1色譜條件測定提取液中綠原酸、黃芩苷、連翹苷含量。

所得黃芩苷、連翹苷、綠原酸的含量計算公式為:

含量(mg/g)=CV/M

其中C表示樣品溶液中被測物質(zhì)的濃度(mg/mL);V表示樣品溶液的體積(mL);M表示粉末的干重(g)。

1.2.3 含量測定

1.2.3.1 HPLC色譜條件

參考文獻[9],金銀花、黃芩、連翹中活性成分的含量測定使用安捷倫1260液相系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司,美國),含在線真空脫氣機、G1311C高壓四元泵、G1329B 自動進樣器、G1314B VWD檢測器、GT-30 柱溫箱。色譜柱:Venusil XBP-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm 5 μm,100 ?),流速:1.0 mL/min,進樣量:10 μL,檢測波長:278 nm和324 nm,流動相:甲醇(A)和0.5%磷酸水溶液(B)，洗脫條件:0～30 min,10%～35%(B);30～50 min,35%(B)。

1.2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品14.5 mg,連翹苷對照品10.2 mg,黃芩苷對照品27.9 mg,于100 mL容量瓶,加入甲醇溶解定容,即得(即配即用)對照品貯備液。

1.2.3.3 標準曲線的繪制

分別精密量取對照品儲備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL至10 mL容量瓶并用甲醇稀釋定容,在上述色譜分析條件下各測定3次。以分析所得峰面積為縱坐標(y),各個對照品溶液所對應(yīng)濃度為橫坐標(x),分別得到各對照品的標準曲線。

1.2.3.4 方法學考察

(1)精密度試驗

取3種對照品溶液,1 d內(nèi)各連續(xù)進樣6次,計算各色譜峰的峰面積(A)和保留時間的RSD值,考察日內(nèi)精密度。取同一供試品溶液,連續(xù)3 d,每天進樣3次,測定日間精密度。

(2)重復(fù)性試驗

將同一批金銀花,連翹,黃芩飲片,按照正交試驗優(yōu)化所得的條件制備供試品溶液,取樣品6份重復(fù)測定,得到3種主要有效成分的對應(yīng)峰的峰面積和保留時間的RSD值。

(3)穩(wěn)定性試驗

按正交試驗優(yōu)化所得的條件制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液分別于2、4、6、8、10、12、24 h進行分析測定,得到3種主要有效成分的對應(yīng)峰的峰面積和保留時間的RSD值。

(4)準確度試驗

利用加樣回收法,稱定黃芩飲片粉末(0.125 g),連翹飲片粉末(0.25 g),金銀花飲片粉末(0.125 g),分別按3種物質(zhì)質(zhì)量百分含量的50%、100%、150%加入3種物質(zhì)的標準品,按照優(yōu)化所得到的最終條件提取樣品,分析并計算3種物質(zhì)的加樣回收率及RSD值。

1.2.4 超高壓提取的單因素試驗

采用單因素試驗法,以含水量(A)、提取壓力(B)、提取時間(C)、固液比(D)為影響因素,綠原酸、黃芩苷、連翹苷含量為評價指標。

1.2.4.1 含水量篩選

稱取黃芩飲片(0.125 g),連翹飲片(0.25 g),金銀花飲片(0.125 g),配制5 mL含水量分別為10%、20%、30%、40%、50%的ChCl-LA低共熔溶劑,將藥材和溶劑真空包裝在PE袋中,將封裝好的樣品放入超高壓設(shè)備中,設(shè)定保壓時間4 min,提取壓力400 MPa對其進行超高壓處理,將處理后的樣品進行離心過濾,按照1.2.3.1色譜條件測定提取液中綠原酸、黃芩苷、連翹苷含量。

1.2.4.2 提取時間考察

稱取黃芩飲片(0.125 g),連翹飲片(0.25 g),金銀花飲片(0.125 g),選擇1.2.4.1中優(yōu)化得到的40%的含水量,5 mL ChCl-LA作為溶劑,真空包裝在PE袋中,將上述樣品放入超高壓儀器樣品孔,固定保壓時間1、2、4、5、6、8、10 min。設(shè)置提取壓力為400 MPa對其進行超高壓處理,將處理后的樣品進行離心過濾,按照1.2.3.1色譜條件測定提取液中綠原酸、黃芩苷、連翹苷含量。

1.2.4.3 提取壓力考察

稱取黃芩飲片(0.125 g),連翹飲片(0.25 g),金銀花飲片(0.125 g),選擇1.2.4.1中優(yōu)化得到的40%含水量,5 mL ChCl-LA作為溶劑,真空包裝在PE袋中,將上述樣品放入超高壓儀器樣品孔中,固定1.2.4.2中優(yōu)化得到的保壓時間4 min,設(shè)置提取壓力分別為100、200、300、400、500、600 MPa對其進行超高壓處理,將處理后的樣品進行離心過濾,按照1.2.3.1色譜條件測定提取液中綠原酸、黃芩苷、連翹苷含量。

1.2.4.4 固液比篩選

稱取黃芩飲片(0.125 g),連翹飲片(0.25 g),金銀花飲片(0.125 g),選擇1.2.4.1中優(yōu)化得到的40%含水量,分別加入3、4、5、6、7、8、9 mL ChCl-LA低共熔溶劑,真空包裝在PE袋中,將封裝好的樣品放入超高壓設(shè)備中,設(shè)置提取壓力為400 MPa,保壓時間4 min,進行超高壓處理,將處理后的樣品進行離心過濾,按照1.2.3.1色譜條件測定提取液中綠原酸、黃芩苷、連翹苷含量。

1.2.5 正交試驗

為進一步確定最佳超高壓提取條件和各因素的影響順序,選定低共熔含水量、提取壓力、提取時間、固液比4個考察因素,各因素選擇3個水平,按L9(34)正交表進行了實驗。

1.2.6 提取方法比較研究

為驗證優(yōu)化所得提取方法的有效性,我們將其與藥典法進行了比較。

1.2.6.1 藥典提取方法(Pharmacopoeia)

稱取黃芩飲片粉末5 g,連翹飲片粉末10 g,金銀花飲片粉末5 g, 按照雙黃連口服液的藥典提取方法進行提取[10],將處理后的樣品進行離心并過濾,計算各主要成分含量。

1.2.6.2 超高壓輔助低共熔溶劑提取方法(DESs-UPE)

稱取黃芩飲片粉末5 g,連翹飲片粉末10 g,金銀花飲片粉末5 g,加入含水量為30%的低共熔溶劑(ChCl-LA,摩爾比1∶1)160 mL,混合置于聚乙烯袋(PE)內(nèi)抽真空密封,將上述封裝好的樣品放入超高壓設(shè)備中,設(shè)置提取條件(提取壓力為400 MPa,提取時間為4 min)。提取完畢后,對其進行離心過濾,按照1.2.3.1色譜條件測定提取液中各主要成分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的制備

結(jié)果表明(表1),3個提取化合物在測定范圍內(nèi)線性良好(r2> 0.999)。其中綠原酸的線性范圍為0.014 5～0.145 0 μg/mL,連翹苷的線性范圍為0.010 2～0.102 0 μg/mL,黃芩苷的線性范圍為0.027 9～0.279 0 μg/mL。

表1 3種活性成分標準曲線

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度的考察

精密度試驗結(jié)果表明(表2和表3),日內(nèi)及日間精密度的相對標準偏差(RSD)都小于3%,說明該方法的精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性考察

試驗結(jié)果如表4所示,3種主要有效成分所得RSD都小于3%,表明試驗重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性結(jié)果表明(表5),3種主要有效成分所得RSD均小于3%,表明樣品溶液在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

表2 考察日內(nèi)精密度所得實驗結(jié)果

表3 考察日間精密度所得實驗結(jié)果

表4 重復(fù)性實驗結(jié)果

2.2.4 準確度考察

加樣回收率試驗結(jié)果表明(見表6、表7、表8),由表中數(shù)據(jù)可知,3種活性成分的加樣回收率均在95%～105%范圍內(nèi),表明該方法回收率高,滿足分析測定的要求。

2.3 單因素考察實驗

2.3.1 含水量對提取液中黃芩苷、綠原酸、連翹苷含量的影響

含水量對低共熔溶劑的黏度、表面張力以及極性等起著很重要的作用,通過低共熔溶劑中添加水可以影響提取的效果。因此,我們考察了含水量分別為 10%、20%、30%、40%、50%的低共熔溶劑對3種活性成分提取效果的影響。圖1結(jié)果表明,在相同的高壓提取條件下,低共熔溶劑含水量為40% 時對綠原酸、連翹苷、黃芩苷3種活性成分的提取效果最好,分別為29.72 mg/g,5.9 mg/g,112.81 mg/g,這可能是因為加入水后低共熔溶劑的黏度減小、低共熔溶劑對樣品的滲透作用增強,導(dǎo)致提取效率提高[11]。但當含水量超過40%時,3種活性成分的提取含量反而降低,這可能是由于加入過量的水,使低共熔溶劑極性增大,從而破壞了低共熔溶劑體系內(nèi)部的氫鍵作用,導(dǎo)致目標成分溶解度降低[12]。所以后續(xù)實驗選擇了40%含水量的低共熔溶劑。

表5 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表6 綠原酸加樣回收率

表7 連翹苷加樣回收率

表8 黃芩苷加樣回收率

Fig.1 Effect of water content in DESs on the extraction content圖1 不同含水量的低共熔溶劑對提取含量的影響

2.3.2 保壓時間對提取液中黃芩苷、綠原酸、連翹苷含量的影響

保壓時間對3種活性成分提取含量的影響如圖2所示,保壓時間達到4 min時,3種有效成分的提取含量達到最高,當繼續(xù)延長時間時對提取含量影響不大。這是因為超高壓提取的過程是先增加壓力,保持一段時間使植物細胞內(nèi)外壓力達到平衡后突然泄壓,在增壓過程中,細胞內(nèi)外滲透壓力突然增大,溶劑在高壓下迅速滲透到細胞內(nèi),慢慢達到溶解平衡; 卸壓過程中由于壓力的突然降低,這導(dǎo)致有效成分能夠穿過細胞的各種膜而轉(zhuǎn)移到細胞外,從而達到高效提取的目的[13]。這表明植物細胞在400 MPa 高壓下破裂很快,4 min時已充分破裂,細胞溶解已達到平衡,提取含量達到最高。故選擇保壓時間4 min進行下一步實驗。

Fig.2 Effect of retention time of UPE on the extraction content圖2 不同保壓時間對提取含量的影響

2.3.3 提取壓力對提取液中黃芩苷、綠原酸、連翹苷含量的影響

超高壓提取壓力對3種活性成分提取含量的影響如圖3所示,在壓力為100～400 MPa范圍內(nèi),隨著超高壓壓力的加大,3種活性成分的提取含量一直增加。在400 MPa時,各成分的提取含量達到最大,而在壓力超過400 MPa后,有效成分提取含量反而呈現(xiàn)下降的趨勢?？梢?在一定范圍內(nèi)(100～400 MPa),超高壓壓力的增加對提取效率起著正向相關(guān)的作用。這與樊振江等和王居偉的提取效果相似[14-15],提高壓力可以有助于溶劑擴散到物質(zhì)細胞內(nèi)部,使物質(zhì)被溶劑浸潤的速度加快,細胞壁和胞內(nèi)各種膜被破壞,細胞內(nèi)外平衡被打破,降低了有效成分的傳質(zhì)阻力,加快了有效物質(zhì)向外擴散的速率[16]。而當壓力大于400 MPa后,較大的壓力使藥材破碎的程度加大,形成過多的小顆粒堵塞了活性成分的溶出通道,同時部分活性成分被破碎的組織細胞所吸附,使得提取效率反而降低,因此,選擇400 MPa作為合適的壓力進行下一步實驗。

Fig.3 Effect of extracting ultrahigh pressure on the extraction content圖3 不同壓力對提取含量的影響

2.3.4 固液比對提取液中黃芩苷、綠原酸、連翹苷含量的影響

固液比對3種活性成分提取含量的影響如圖4所示,由圖4 看出,隨著固液比的增大,即加入的溶劑量增加,提取含量增加,當固液比超過1∶8時,提取含量增加緩慢,趨于穩(wěn)定。固液比對提取含量的影響主要是由于隨著固液比的增大,有效成分從組織內(nèi)向外溶出的過程中,濃度梯度和擴散速率也隨之升高,有利于提取效率的提高。當有效成分達到一定溶出極限后,提取含量也不會再隨著固液比的增加而升高[17]。所以我們選定1∶8作為最佳固液比進行下一步實驗。

Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the extraction content圖4 不同固液比對提取含量的影響

2.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用正交試驗法對復(fù)方雙黃連有效成分的提取條件進行優(yōu)選,因素與水平的設(shè)計和試驗結(jié)果分別見表9和表10,由極差分析結(jié)果可知,因素A對應(yīng)K值為K1>K2>K3,因素B、D對應(yīng)K值均為K2>K1>K3,因素C對應(yīng)K值為K2>K3>K1,在極差R的比較中,發(fā)現(xiàn)影響3種有效成分提取效果的因素按主要程度排序為D(固液比)>A(含水量)>C(提取時間)>B(提取壓力)。綜合考慮單因素考察及正交試驗結(jié)果,將超高壓輔助低共熔溶劑提取復(fù)方雙黃連有效成分的最佳提取條件定為:30%含水量,壓力400 MPa,時間4 min,固液比1∶8。綜合評分要以各指標的最大值為參照將數(shù)據(jù)進行歸一化處理,再給出不同的權(quán)重。在本實驗中,綠原酸、連翹苷及黃芩苷3種物質(zhì)均為復(fù)方雙黃連的主要成分,因此將其權(quán)重系數(shù)均設(shè)為0.33,進行加權(quán)求和,得綜合評分(Y)=0.33X1/Xmax1+0.33X2/Xmax2+0.33X3/Xmax3,所得正交試驗結(jié)果及極差分析如表10所示。

表9 正交試驗因素水平表

表10 L9(34)正交實驗結(jié)果及極差分析表

2.3.6 正交試驗驗證

按正交實驗所得的超高壓提取的最佳條件A1B2C2D2,即30%含水量,壓力400 MPa,時間4 min,固液比1∶8,平行做3組驗證試驗,結(jié)果為綠原酸含量為29.77 mg/g,黃芩苷含量為112.66 mg/g,連翹苷含量為5.99 mg/g。從表11中驗證結(jié)果顯示,綠原酸、連翹苷、黃芩苷各物質(zhì)含量的RSD均小于3%,表明優(yōu)化所得超高壓輔助低共熔溶劑提取復(fù)方雙黃連有效成分的條件合理可行。

表11 正交試驗驗證

2.4 與藥典方法作比較

按照藥典提取方法和1.2.6.2 超高壓輔助低共熔溶劑提取方法,測得綠原酸、黃芩苷、連翹苷含量,結(jié)果列于表12。結(jié)果顯示,超高壓輔助低共熔溶劑法可以有效提取3種有效成分,與藥典提取方法相比,綠原酸、黃芩苷、連翹苷含量均有所提高。

表12 提取方法比較(n=3)

3 結(jié)論

本文采用綠色、環(huán)保的低共熔溶劑ChCl-LA(1∶1)超高壓輔助提取黃芩中的黃芩苷、連翹中的連翹苷、金銀花中的綠原酸3種復(fù)方雙黃連的有效成分,考察了低共熔溶劑的含水量以及超高壓提取壓力、固液比、提取時間等對活性成分含量的影響,并同時采用正交試驗法對提取條件進行了優(yōu)化,確定了最佳的提取參數(shù)。同時通過方法學考察對其含量測定方法進行了驗證。結(jié)果表明,選定的低共熔溶劑含水量為30%，提取壓力為400 MPa,提取時間為4 min,固液比為1∶8,在上述優(yōu)化條件下進行了驗證試驗,綠原酸含量為29.77 mg/g，黃芩苷含量為112.66 mg/g,連翹苷含量為5.99 mg/g,此方法對提取液中有效成分的含量要高于藥典提取法,為雙黃連制劑的制備提供了新的思路,值得進一步推廣。