王雪琦，張珍*，徐紅艷，劉倩，李曉葉，郝旭東，趙文寶，周蕓

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 2(慶陽市食品檢驗檢測中心，甘肅 慶陽，745000)

我國是一個畜牧業(yè)大國，每年的畜肉生產(chǎn)和消費總量均處于世界前列，畜禽骨資源極為豐富且價格低廉[1]。羊骨是羊肉加工過程中的副產(chǎn)品，但由于對羊骨相關開發(fā)和綜合利用方面欠缺，大部分羊骨被丟棄，或者制成附加值較低的飼料，導致其資源化利用比例大大降低[2-3]。鈣是人體中所必需且最豐富的無機元素，占總體重的1.5%～2.2%[4]，在骨骼生長、細胞內(nèi)代謝、血液凝固、神經(jīng)傳導、肌肉收縮和心臟功能中起著重要作用[5-6]。中國的成年人平均每日鈣攝入量(RDA)約為800 mg，青少年和老年人每日攝入量為1 200 mg，若鈣攝取不足會導致代謝性骨病，如兒童佝僂病和老年人骨質(zhì)疏松癥，更嚴重會引發(fā)骨軟化癥[7]。

羊骨營養(yǎng)豐富，含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和最適人體吸收的鈣磷鹽[8]。其中鈣的存在形式主要以磷酸鈣構成的羥基磷灰石結晶存在，溶解度很低，若想促進骨鈣的利用，必須破壞其羥基磷灰石結晶結構才能得到游離態(tài)鈣[9]。目前提取骨骼中可溶性鈣的方法有酸解、酶解、堿解和微生物發(fā)酵等[10]。酸解法可能會破壞蛋白的生物活性；微生物發(fā)酵法時間成本過高；堿解法氨基酸受損較為嚴重[11]。酶解可分解鮮骨中的蛋白質(zhì)，使骨鈣充分游離出來，溫度較低，提取時間較短，且對環(huán)境的污染也較小[12]。

當前關于酶法提取骨骼中可溶性鈣的報道主要集中于單酶提取[13-15]，但是單酶對骨鈣的提取效果一般。提高骨鈣的溶出，本試驗用雙酶分步酶解法對羊骨中可溶性鈣進行提取，選用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，采用響應面法分別優(yōu)化2者的提取條件，接著在各自最優(yōu)條件下按照不同加入順序和時間組合分步酶解羊骨粉，制備富含游離鈣的羊骨酶解液，旨在提高羊骨的有效利用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊骨：采自于甘肅省甘南藏族自治州瑪曲縣歐拉鄉(xiāng)的藏綿羊。

木瓜蛋白酶(800 U/mg)、胃蛋白酶(1∶3 000)、氧化鑭、HNO3、NaOH、HCl,均購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-4A恒溫攪拌水浴鍋，常州金壇精達儀器制造有限公司；PHS-3C pH計，上海寧隆儀器有限公司；FA2004B分析天平，上海越平科學儀器有限公司；H-1850R型臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；novAA400P智能火焰-石墨爐原子吸收儀，北京宏昌信科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊骨粉的制備

參考譚貝妮等[16]的方法，并做適當修改。羊骨先經(jīng)流水沖洗，剔除大塊的碎肉、筋等，再水煮去脂(2 h，95 ℃)，接著高壓蒸煮(121 ℃，70 min)，烘干(60 ℃，6 h)，待溫度降至室溫，粉碎(28 000 r/min)，過篩(60目)，骨粉干燥保存。

1.3.2 羊骨粉的酶解

參考TAN的方法[17]，并做適當調(diào)整。準確稱取適量羊骨粉樣品，加入一定量水(料液比1∶20)，在恒溫水浴條件下處理10 min使其完全溶解，調(diào)節(jié)溶液pH到設定值，按條件加酶(加酶量U/g羊骨粉)，酶解一定時間(酶解過程中保持pH恒定，前1 h，每15 min調(diào)1次pH；2 h后，每30 min調(diào)1次pH；3 h后，每1 h調(diào)1次pH)，反應結束后，沸水浴15 min滅酶活，冷卻至室溫后，離心取上清液，每個試驗重復3次。

1.3.3 酶解單因素試驗

參考LOSSO[18]和TIAGO等[19]的方法，并做相應修改。本試驗以酶解溫度、酶解時間、酶解pH和加酶量為試驗因素，每個因素設計5個水平，每個水平重復3次。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的單因素試驗水平表為表1。

表1 單因素試驗水平表

注：x代表木瓜蛋白酶；X代表胃蛋白酶。下同。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗設計

在木瓜蛋白酶和胃蛋白酶單因素試驗的基礎上，分別采用Box-Benhnken中心組合設計[20]，以時間(A)、溫度(B)、pH(C)和加酶量(D)為影響因素，游離鈣含量(R)為響應值設計4因素3水平響應面優(yōu)化試驗，因素水平編碼見表2。

表2 響應面試驗因素水平表

1.3.5 兩種酶分步酶解試驗

響應面優(yōu)化試驗下得到的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在各自最優(yōu)酶解溫度、酶解pH和加酶量條件下，將2種酶按酶解的不同順序和不同時間進行分步酶解試驗(表3)。

1.3.6 鈣含量的測定

鈣含量參照國家標準火焰原子吸收光譜法(GB 5009.92—2016)測定。

表3 分步酶解試驗設計表

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Design-Expert 8.0.6進行響應面試驗設計及結果分析，采用IBM SPSS statistics 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，Origin 8.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶解溫度對游離鈣含量的影響

由圖1可知，游離鈣含量隨著對羊骨粉酶解溫度的升高，整體趨勢呈先上升后下降。當木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的酶解溫度分別在55、40 ℃時，游離鈣含量顯著高于其他酶解溫度時的含量(P<0.05)，達到最高58.23和806.59 mg/100 g，相比最低含量提高了33.80%、38.55%。再隨著溫度的繼續(xù)升高，游離鈣含量降低，其原因可能是酶解溫度在適宜范圍內(nèi)升高使得反應體系中分子的運動速率加快，酶與底物碰撞的次數(shù)也增加，酶解反應進程也加快；但溫度過高時，酶分子結構的部分次級鍵斷裂，導致酶一定程度的失活，酶水解效率降低[21]，游離鈣含量也降低。所以本試驗選取木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的酶解溫度分別為55和40 ℃作為后續(xù)研究參數(shù)。

圖1 酶解溫度對游離鈣含量的影響

Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on free calcium content

注：圖中小寫字母表示組內(nèi)差異顯著(P<0.05)。下同。

2.1.2 加酶量對游離鈣含量的影響

由圖2可知，游離鈣含量隨著酶添加量的增加呈先上升后平緩的趨勢。當木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的加酶量均在5 000 U/g時是曲線的轉折點，游離鈣含量分別達到54.45和761.41 mg/100 g，相比最低含量提高了58.81%、41.59%，之后再隨著加酶量的繼續(xù)增大，游離鈣含量上升不顯著。其原因可能是在適宜的加酶量范圍內(nèi)，酶與底物能夠充分結合，從而游離鈣含量增長較快[22]；當酶過量時，底物逐漸被酶所飽和，超量酶分子就無法和底物進行相互作用，同時酶的活性中心會被其他過量的酶所覆蓋，影響酶解效率[23]，游離鈣含量增長也變得緩慢，所以本試驗選擇木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的加酶量5 000 U/g作為后續(xù)研究參數(shù)。

圖2 加酶量對游離鈣含量的影響

Fig.2 Effect of enzyme dosage on free calcium content

2.1.3 酶解pH對游離鈣含量的影響

由圖3可知，在一定的pH范圍內(nèi)，游離鈣含量是隨pH增大呈先增加后降低的趨勢。當木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶解pH值分別為6和2.5時，游離鈣含量顯著高于其他酶解pH時的含量(P<0.05)，達到最高61.85和800.26 mg/100 g，相比最低含量提高了38.78%、36.91%。其原因可能是酶對反應體系的pH有一定的敏感性[24]，在pH的作用下，酶分子的空間構象會發(fā)生改變，從而會影響酶與蛋白質(zhì)之間的解離狀態(tài)[25]，當木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的酶解pH分別為6和2.5時，可使更多酶的活性位點外露，增加酶活力，使游離鈣含量達到最高。所以本試驗選取木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的pH值分別為6和2.5作為后續(xù)研究參數(shù)。

圖3 酶解pH對游離鈣含量的影響

Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis on free calcium content

2.1.4 酶解時間對游離鈣含量的影響

由圖4可知，游離鈣含量隨著酶解時間的不斷延長，先上升后趨于平緩。當木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的酶解時間均在4 h時，游離鈣含量分別達到56.45和898.81 mg/100 g，相比最低含量提高了51.16%、45.48%。再隨著酶解時間的繼續(xù)延長，游離鈣含量增長趨于平緩，其原因可能是在酶解初期，酶活性位點較多，使得酶解效率上升趨勢明顯，而隨著反應時間不斷延長，暴露的酶活性位點相對較少且大多數(shù)底物已經(jīng)被酶解，使反應速率逐漸下降，反應強度減弱[26]；從生產(chǎn)效率來看，時間的延長會使生產(chǎn)效率降低[27]。所以本試驗選取木瓜蛋白酶、胃蛋白酶最適酶解4 h作為后續(xù)研究參數(shù)。

圖4 酶解時間對游離鈣含量的影響

Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on free calcium content

2.2 酶解工藝響應面優(yōu)化

2.2.1 木瓜蛋白酶響應面優(yōu)化

在木瓜蛋白酶單因素試驗的基礎上，利用Design-Expert 8.0設計軟件，采用Box-Behnken中心組合試驗設計方案及結果見表4。

表4 木瓜蛋白酶響應面設計及結果表

以酶解時間、酶解溫度、酶解pH值和加酶量對酶解工藝參數(shù)進行優(yōu)化，獲得二次回歸方程為：R=76.25-0.23A-1.37B+4.36C+0.74D+6.27AB-3.90AC-2.72AD-0.20BC+4.54BD-1.25CD-17.68A2-25.80B2-23.07C2-18.92D2。同時，對模型進行方差分析的顯著性檢驗，見表5。

表5 木瓜蛋白酶二次回歸方程模型方差分析表

注：**表示該指標極顯著P<0.01；*表示該指標顯著0.01

F值越大，響應曲面越陡，說明2種因素之間的相互作用越明顯[28-29]。方差分析表可以看出交互項AB差異性達到極顯著水平(P<0.01)，交互項AC、BD達到顯著水平(P<0.05)，交互項AD、BC、CD影響均不顯著(P>0.05)，二次項A2、B2、C2、D2的P值均小于0.000 1，說明4個因素對游離鈣含量具有顯著的二次效應，各因素對游離鈣含量的影響大小順序為：酶解pH>酶解溫度>加酶量>酶解時間，并且各考察因素對游離鈣含量影響具有交互作用，并不是簡單的線性關系，因此，可用此回歸方程試驗結果進行分析及預測。

此模型得到的木瓜蛋白酶提取羊骨中可溶性鈣的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶解溫度54.86 ℃、酶解時間3.98 h、酶解pH 6.05、加酶量5 015.03 U/g，其游離鈣含量達到76.49 mg/100 g。驗證試驗時，考慮到操作的可行性，將最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為酶解溫度55 ℃、酶解時間4 h、酶解pH 6.0、加酶量5 000 U/g，此酶解條件在響應面設計方案中已涉及，得到的游離鈣含量最高是79.02 mg/100 g，與理論值基本相符。

2.2.2 胃蛋白酶響應面優(yōu)化

綜合胃蛋白酶單因素試驗結果，以酶解時間、酶解溫度、酶解pH值和加酶量為考察因素，采用Box-Behnken中心組合試驗設計方案結果見表6。

根據(jù)Design-Expert 8.0軟件進行多元回歸擬合后，獲得二次回歸方程為：R=1 004.58+20.21A+20.70B+29.19C+48.58D+14.48AB-83.47AC-20.54AD-2.92BC+96.77BD-46.92CD-125.51A2-282.06B2-251.13C2-150.63D2。同時，對模型進行方差分析的顯著性檢驗，結果見表7。

表6 胃蛋白酶響應面設計及結果表

表7 胃蛋白酶二次回歸方程模型方差分析表

此模型得到的胃蛋白酶提取羊骨中可溶性鈣的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶解溫度40.34 ℃、酶解時間4.06 h、酶解pH 2.52、加酶量5 348.28 U/g，其游離鈣含量達到1 010.58 mg/100 g。驗證試驗時，考慮到操作的可行性，將最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為酶解溫度40 ℃、酶解時間4 h、酶解pH 2.5、加酶量5 300 U/g，平行3次，得到的游離鈣含量是1 008.68 mg/100 g，與理論值基本相符。

2.3 2種酶分步酶解試驗結果

圖5中，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在不同酶解順序下，對比4種不同酶解時間組合(1 h+1 h、2 h+2 h、3 h+3 h和4 h+4 h)，可看出時間組合(3 h+3 h)時所得的游離鈣含量是最多的，極顯著高于1 h+1 h、2 h+2 h、4 h+4 h時間組合(P<0.01)；同時先木瓜蛋白酶后胃蛋白酶酶解羊骨粉所得游離鈣含量在任何1種時間組合中都顯著高于先胃蛋白酶后木瓜蛋白酶(P<0.01)。所以本試驗的最優(yōu)酶解組合為：在2種酶各自最優(yōu)酶解溫度、酶解pH、加酶量條件下，先木瓜蛋白酶酶解3 h，后胃蛋白酶繼續(xù)酶解3 h，最終得到的游離鈣含量最高，可達到1 839.14 mg/100 g，相比1 h+1 h、2 h+2 h和4 h+4 h時間組合酶解分別提高了62.30%、35.98%、17.81%。

圖5 不同酶解順序和時間組合對游離鈣含量的影響

Fig.5 Effects of different enzymatic hydrolysis sequences and time combinations on free Calcium content

注：圖中大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)；小寫字母表示組內(nèi)差異極顯著(P<0.01)。

3 結論

通過單因素試驗和響應面優(yōu)化結果，確定了木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分別提取羊骨中可溶性鈣的最佳工藝條件：酶解溫度55、40 ℃、酶解時間均為4 h、酶解pH 6.0、2.5，加酶量5 000、5 300 U/g，所測實際游離鈣含量是79.02 mg/100 g和1 008.68 mg/100 g；在2種酶各自最優(yōu)條件下按不同加入順序和不同時間組合酶解羊骨粉，確定最優(yōu)條件為先加木瓜蛋白酶酶解3 h，后加胃蛋白酶酶解3 h，酶解液游離鈣含量達到最高1 839.14 mg/100 g；雙酶分步酶解羊骨粉得到的游離鈣含量極顯著高于單一添加酶(P<0.01)，相比木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分別提高了95.70%和45.15%，為羊骨可溶性鈣的提取提供了理論基礎。