陳燕玲,羅 婷,高昕樂,陳 陽,吳秀香,凡 棟,艾 寒,靳俊峰,莊曉東

作者單位：519041珠海，遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)基礎(chǔ)病理生理學(xué)教研室[陳燕玲（理學(xué)博士）、羅 婷、高昕樂、吳秀香、凡 棟、艾 寒、靳俊峰]；519041珠海，遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)珠海市中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（陳 陽）；510080廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科(莊曉東)

0 引 言

對(duì)比劑腎病是在診斷和介入手術(shù)中應(yīng)用含碘對(duì)比劑后發(fā)生的重要并發(fā)癥，是引起醫(yī)源性急性腎功能衰竭的常見病因，占所有急性腎功能衰竭患者總?cè)藬?shù)的12%［1］。對(duì)比劑腎病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為對(duì)比劑腎病的發(fā)生主要與對(duì)比劑對(duì)腎小管的直接毒性作用，腎臟內(nèi)微血管的改變，氧化應(yīng)激及炎癥等有關(guān)［2-5］。在這些因素中，越來越多的研究證實(shí)炎性損傷在對(duì)比劑腎病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。最近一項(xiàng)研究指出，Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）-NOD樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體通路是對(duì)比劑腎病發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一。用碘普羅胺建立的大鼠急性腎衰竭模型及NRK-52E細(xì)胞損傷模型中，TLR4蛋白及NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)均增加，而加入TLR4抑制劑及NLRP3-siRNA后，可以改善碘普羅胺引起的腎損傷［6］。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)均明顯增加，說明NLRP3炎癥小體的激活參與了對(duì)比劑腎病的發(fā)生［7］。

N-乙酰半胱氨酸（N-Acety-L-Cysteine，NAC）是臨床常用藥，主要用于治療慢性呼吸道感染，具有抗氧化及抗炎作用［8］。目前，盡管對(duì)NAC預(yù)防對(duì)比劑腎病發(fā)生的作用還存在爭議，但許多臨床試驗(yàn)表明NAC結(jié)合水化治療在對(duì)比劑腎病的防治中具有良好的效果［9］。本實(shí)驗(yàn)以HK-2細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察NAC對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用，為NAC防治對(duì)比劑腎病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)HK-2細(xì)胞株由中山大學(xué)高血壓研究所提供，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液、DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；細(xì)胞裂解液試劑盒（RIPA裂解液）為上海碧云天試劑公司產(chǎn)品；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；NAC及DCFH-DA為美國Sigma公司產(chǎn)品；碘普羅胺（碘濃度為370 mgI/mL）為拜耳醫(yī)藥公司產(chǎn)品；Bax、Bcl-2、NLRP3、IL-1β、Caspase-1、核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）及內(nèi)參GAPDH等Ⅰ抗及相應(yīng)的Ⅱ抗為美國CST公司產(chǎn)品；ASC抗體為美國Absin公司產(chǎn)品。ECL超敏發(fā)光液為北京普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 熒光倒置顯微鏡為德國OLYMPUS公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為德國PARTEC公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 分為對(duì)照組、碘普羅胺組（加入111 mgI/mL碘普羅胺處理24 h）、碘普羅胺+不同濃度NAC處理組（111 mgI/mL碘普羅胺與2、4、8、16、32 mmol/L NAC共孵育24 h）。碘普羅胺及NAC濃度設(shè)置文獻(xiàn)［7］及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［10］。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞存活率HK-2細(xì)胞按2×105個(gè)/mL接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁并長至鋪滿孔底約85%時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的NAC及碘普羅胺。24 h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK-8溶液（用無血清培養(yǎng)基配制，培養(yǎng)基與CCK-8的比例為1∶9），繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定每孔的吸光度值（A值），計(jì)算細(xì)胞存活率，公式如下：

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測HK-2細(xì)胞按3×104個(gè)/mL接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁并長至鋪滿孔底約85%時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的NAC及碘普羅胺處理24 h。每孔加入1 mL終濃度為1 μg/L的DCFH-DA，避光孵育30 min后，棄培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞并收集至15 mL離心管中，用PBS洗3次，去除沒有裝載到細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA染料，離心后用PBS重懸，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.2.4 DAPI染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)HK-2細(xì)胞按3×104個(gè)/mL接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁并長至鋪滿孔底約85%時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的NAC及碘普羅胺處理。24 h后棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，每孔加入1 mL終濃度為1 μg/L的DAPI，避光孵育20 min后，吸出染色液，PBS洗3次去除多余的染色液，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)并隨機(jī)選取8個(gè)不同的視野進(jìn)行拍照。

1.2.5 Western blot檢測HK-2細(xì)胞按3×103個(gè)/mL接種于10 cm培養(yǎng)皿中，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的NAC及碘普羅胺處理24 h后，用PBS洗3次，加入RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞。蛋白定量后每組取60μg蛋白加入上樣緩沖液，沸水中煮5min，使蛋白質(zhì)完全變性和解聚。根據(jù)目的蛋白分子量配制不同百分比的聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳（8%～12%），電泳條件：80 V恒壓，30 min；然后120 V恒壓，60～80 min；電轉(zhuǎn)：220 mA恒流轉(zhuǎn)60～120 min。電轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用5%脫脂奶粉封閉60 min，依次加入相應(yīng)的Ⅰ抗（Bax、Bcl-2、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、NF-κB、GAPDH）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，Ⅰ抗在4℃下孵育過夜，Ⅱ抗在室溫下孵育60 min，TBST洗3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光液放入暗盒中壓片顯影或經(jīng)Jena成像儀掃描成像，再經(jīng)ImageJ軟件分析各組條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t法，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NAC對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組的細(xì)胞存活率（100%±4.749%）比較，碘普羅胺組HK-2細(xì)胞細(xì)胞存活率（48.819%±2.045%）明顯降低；與碘普羅胺組比較，加入2、4、8、16、32 mmol/L的NAC處理后，細(xì)胞存活率（55.40%±3.61%、58.95%±2.86%、61.53%±5.18%、59.85%±6.37%、59.09%±6.29%）明顯增高（P＜0.05）。

2.2 NAC對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，碘普羅胺組HK-2細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax/Bcl-2比值明顯增高（P＜0.05）；與碘普羅胺組相比，不同濃度的NAC處理組Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比值明顯降低（P＜0.05）。見表1，圖1。

圖1 NAC對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Figure 1Expressions of Bax and Bcl-2 proteins in different groups of the HK-2 cells

表1 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值(xˉ±s,n=3)Table 1Expressions of Bax and Bcl-2 proteins and Bax/Bcl-2 ratios in different groups of the HK-2 cells(xˉ±s,n=3)

2.3NAC對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 用DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的低密度藍(lán)色熒光。經(jīng)碘普羅胺處理后，部分細(xì)胞核呈現(xiàn)局部致密濃染的藍(lán)色熒光，并且出現(xiàn)核固縮或核分裂等凋亡細(xì)胞的典型特征，而加入不同濃度的NAC處理后，出現(xiàn)核固縮或核分裂的細(xì)胞數(shù)明顯減少，見圖2。

2.4 NAC對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響DCFH-DA染料經(jīng)水解及ROS氧化后可生成帶綠色熒光的DCFH。DCFH的含量與細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈正比，DCFH含量越高，綠色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示，與對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度（1502.17±55.91）相比，碘普羅胺組細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度（5050.85±606.76）明顯增強(qiáng)；而加入2、4、8、16、32mmol/L的NAC處理后，細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度（4065.39±160.59、4162.05±28.93、3675.71±50.38、3133.97±66.07、2675.80±92.39）較碘普羅胺組明顯減弱（P＜0.05），見圖3。

2.5 NAC對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)組分及NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，碘普羅胺組HK-2細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)組分（NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β）及NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯增高，而不同濃度的NAC處理組上述蛋白表達(dá)水平較碘普羅胺組明顯降低（P＜0.05），見表3，圖4。

圖2 NAC對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響（×400）Figure 2Apoptosis rates of the HK-2 cells in different groups（×400）

圖3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平Figure 3Levels of ROS in different groups of the HK-2 cells

表3 各組細(xì)胞NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β蛋白表達(dá)水平(xˉ±s,n=3)Table 3Expressions of NF-κB,NLRP3,ASC,Caspase-1 and IL-1β proteins in different groups of the HK-2 cells(xˉ±s,n=3)

圖4 NAC對(duì)碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞NF-κB及NLRP3炎癥小體相關(guān)組分蛋白表達(dá)水平的影響Figure 4Expressions of NLRP3，ASC，Caspase-1 and IL-1β proteins in different groups of the HK-2 cells

3 討 論

本課題組前期已報(bào)道用不同濃度（37、74、111、148 mgI/mL）的碘普羅胺處理HK-2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性下降，可以成功構(gòu)建HK-2細(xì)胞損傷模型［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)中采用111mgI/mL濃度的碘普羅胺處理24 h作為本研究中對(duì)比劑腎病體外模型的條件。

研究報(bào)道，對(duì)比劑可以破壞腎小管上皮細(xì)胞線粒體酶活性并誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿，繼而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程［11］。而預(yù)防性口服抗氧化劑乙酰半胱氨酸可以有效降低慢性腎功能不全者對(duì)比劑腎病的發(fā)病率［12］。本研究中，用111 mgI/mL濃度的碘普羅胺處理HK-2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力明顯降低，Bax/Bcl-2比值明顯增高，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，說明碘普羅胺可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。而加入NAC后，上述效應(yīng)明顯減弱，說明NAC可以對(duì)抗碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。

越來越多的證據(jù)表明，由炎癥體激活介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與急性腎損傷中的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞功能障礙。這些蛋白復(fù)合物是固有免疫的重要組分，可以激活促炎因子IL-1β和IL-18。在眾多已知的炎癥體中，NLRP3炎癥小體是目前研究最多的炎癥體，在多種腎損傷模型中均顯示NLRP3炎癥小體具有損傷作用。研究報(bào)道，與野生型小鼠相比，NLRP3基因敲除小鼠腎小管損傷和炎癥反應(yīng)明顯減輕［13］。缺血-再灌注可誘導(dǎo)小鼠腎組織中NLRP3的表達(dá)增高，NLRP3基因敲除可顯著改善缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷，包括減輕急性腎小管壞死，下調(diào)IL-18和IL-1β的表達(dá)及降低死亡率［14］。最近研究報(bào)道NLRP3在對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷和細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用?；罨腘LRP3可以誘導(dǎo)自身寡聚化并募集含有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（caspase recruitment domain，CARD）的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）及Caspase-1，組成NLRP3炎癥小體［15］。被NLRP3激活的Caspase-1具有促炎效應(yīng)，可以將IL-1β和IL-18前體剪切加工成成熟和活性形式，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。而沉默NLRP3或ASC基因后，可以減輕由威視派克或歐乃派克對(duì)比劑引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷及凋亡［16］。NF-kB和NLRP3炎性小體通路形成信號(hào)軸，IL-1β和IL-18前體的產(chǎn)生依賴于NF-κB信號(hào)通路的激活，而NF-κB抑制劑可以抑制NLRP3的生成［17］。在本研究中，HK-2細(xì)胞經(jīng)111 mgI/mL濃度的碘普羅胺誘導(dǎo)后，NF-κB表達(dá)明顯增加，NLRP3炎癥小體被激活，Caspase-1及IL-1β表達(dá)明顯增高，而加入NAC后，上述蛋白表達(dá)明顯降低。提示NAC可以抑制NF-κB/NLRP3信號(hào)軸。

ROS在對(duì)比劑引起的腎損傷中具有重要作用。對(duì)比劑可引起腎臟缺血-缺氧及氧化應(yīng)激。腎髓質(zhì)缺血可以加速活性氧（ROS）的產(chǎn)生，ROS產(chǎn)生增多會(huì)引起腎小球?yàn)V過率降低［2，18］。ROS是NLRP3炎癥小體激活的觸發(fā)劑，當(dāng)ROS濃度增加時(shí)，硫氧還蛋白互作蛋白可與NLRP3結(jié)合，繼而激活NLRP3［20］。在本研究中，HK-2細(xì)胞經(jīng)碘普羅胺處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，而經(jīng)NAC處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低。提示NAC可能通過抑制ROS的產(chǎn)生抑制NLRP3炎癥小體的激活。

綜上所述，NAC可以減輕碘普羅胺誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與其抑制ROS生成及NF-κB/NLRP3信號(hào)通路的激活有關(guān)。