喬勤勤,文 芳,鄭 楠,薛秀恒,程建波,張 昊,李松勵(lì),王加啟

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京),北京 100193; 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230036;3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

霉菌毒素是由霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝物,通過污染飼料和動(dòng)物性食品(肉、蛋、奶等),對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能以及人類的組織和器官產(chǎn)生極大的危害[1-2]。谷物在生長、收獲、儲(chǔ)藏或加工過程中容易被霉菌毒素污染,世界上每年大約有 25% 的谷物遭受霉菌毒素的污染,嚴(yán)重影響人們健康飲食同時(shí)也造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。食品中霉菌毒素污染已成為我國乃至全世界重點(diǎn)關(guān)注的問題之一,所以研發(fā)出簡(jiǎn)便、快速、靈敏的霉菌毒素檢測(cè)方法對(duì)于食品安全和檢測(cè)方面具有重要意義。近些年來,核酸適配體檢測(cè)技術(shù)因具有高親和力、高特異性、穩(wěn)定性好、易修飾等優(yōu)點(diǎn)得到快速發(fā)展,目前已經(jīng)研發(fā)出的核酸適配體檢測(cè)方法成功應(yīng)用于食品中霉菌毒素的檢測(cè)[5]。

本文介紹了我國和其他國家對(duì)食品中部分霉菌毒素的限量規(guī)定及其危害,簡(jiǎn)要概括了基于SELEX技術(shù)篩選核酸適配體的過程,詳細(xì)地?cái)⑹隽嘶诤怂徇m配體的生物傳感器在食品中檢測(cè)霉菌毒素的相關(guān)應(yīng)用,總結(jié)出核酸適配體研究現(xiàn)狀,進(jìn)一步指出該研究現(xiàn)狀的發(fā)展趨勢(shì)以及對(duì)后續(xù)研究的借鑒意義。

1 食品中霉菌毒素限量規(guī)定及其危害

目前有400多種已知的霉菌毒素對(duì)人類和動(dòng)物具有潛在毒性,常見的霉菌毒素主要包括黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)、赭曲霉毒素(Ochratoxin A,OTA)、伏馬菌素(Fumonisin B1,FB1)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)以及T-2毒素(Mitsubishi T-2)[6-7]。霉菌毒素是人類健康的主要威脅之一[1],AFB1是一種高毒性的食品污染物,已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)列為第1類致癌物[8-9]。OTA對(duì)大多數(shù)哺乳類動(dòng)物有高度的致肝癌、致腎癌、致突變和致畸形等[10]。ZEN及其代謝物會(huì)影響雌性激素分泌,尤其是在哺乳動(dòng)物生殖過程中[11]。T-2毒素可抑制蛋白質(zhì)以及DNA和RNA的合成[12]。因?yàn)樵谧匀粭l件下霉菌毒素天然存在,所以農(nóng)作物在加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存中容易被霉菌毒素污染[13]。因此,只要條件(濕度和溫度)合適,霉菌毒素會(huì)污染食品、農(nóng)作物和飼料[14]。對(duì)含有相對(duì)較高霉菌毒素水平的母牛飼料的研究表明,霉菌毒素及其代謝產(chǎn)物可轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的食品中[15]。為了保護(hù)消費(fèi)者的健康和減少經(jīng)濟(jì)損失,我國標(biāo)準(zhǔn)GB 13078-2017[16]中明確規(guī)定奶牛飼料中霉菌毒素最大殘留限量(表1),標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017[17]對(duì)食品中部分霉菌毒素的限量做出了相關(guān)規(guī)定(表2),歐洲委員會(huì)(European Commission)[18]和國際癌癥研究組織[19]規(guī)定了大多數(shù)食物中霉菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)(表3)。

表1 我國標(biāo)準(zhǔn)GB 13078-2017中規(guī)定奶牛飼料中霉菌毒素最大殘留限量

表2 我國標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017規(guī)定了食品中部分霉菌毒素的限量

表3 歐洲委員會(huì)和國際癌癥研究組織對(duì)部分霉菌毒素的限量規(guī)定

2 霉菌毒素檢測(cè)方法

2.1 霉菌毒素傳統(tǒng)檢測(cè)方法

傳統(tǒng)檢測(cè)霉菌毒素的方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)和質(zhì)譜法(MS)等儀器分析方法以及基于抗體的酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)、免疫傳感器和表面等離子共振(SPR)等免疫分析方法[20-24]。儀器分析方法具有較高的靈敏度、特異性和重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn),免疫分析方法操作便捷、快速以及樣品需要少等,但這些檢測(cè)方法仍然存在一些問題,比如在儀器分析方法在樣品前處理過程中,步驟繁雜、耗時(shí)長且不適合現(xiàn)場(chǎng)操作,同時(shí)需要大量的專業(yè)技術(shù)人員,而免疫分析方法中使用的抗體價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定,制備時(shí)間長,不容易長期存儲(chǔ),檢測(cè)的結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性、假陰性等[25-26]。所以研發(fā)出簡(jiǎn)單、便捷、靈敏的霉菌毒素的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

2.2 霉菌毒素生物傳感器檢測(cè)

目前,基于核酸適配體的生物傳感器因具有易合成、易標(biāo)記、易修飾、靈敏度高、特異性高、分子量小、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)而受到廣泛的關(guān)注[27-28]。國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)對(duì)生物傳感器的定義為利用全細(xì)胞、細(xì)胞器、組織、酶或免疫制劑等生物識(shí)別元件的特異性生化反應(yīng),借助電、光、熱等各種信號(hào)對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的一類裝置[29]。其優(yōu)點(diǎn)是特異性好、靈敏度高、檢測(cè)快速、樣品前處理簡(jiǎn)單且可操作性強(qiáng),在食品分析、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、工業(yè)檢測(cè)與控制等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[30]。最常用的生物識(shí)別元件為核酸適配體、抗體和酶[31-32]。

2.3 生物傳感器中核酸適配體的篩選

核酸適配體是在體外篩選,能高親和力和高特異性結(jié)合目標(biāo)物的單鏈寡核苷酸序列(單鏈DNA(ssDNA)或RNA),最早由Tuerk等[33]發(fā)現(xiàn),由Ellingtin等[34]命名。核酸適配體一般由20～100個(gè)核苷酸組成,其相對(duì)分子質(zhì)量小、性質(zhì)穩(wěn)定、易穿透細(xì)胞膜,可通過重復(fù)的變性循環(huán)來維持其結(jié)構(gòu),可用于檢測(cè)多種目標(biāo)物,包括蛋白質(zhì)、霉菌毒素、農(nóng)獸藥和金屬離子等[35-38]。核酸適配體篩選技術(shù)基本上都是通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)完成的,主要過程包括結(jié)合、分離、洗脫、擴(kuò)增和調(diào)節(jié)[39]。幾乎所有通過SELEX篩選的適配體在微摩爾(μmol)至納摩爾(nmol)范圍內(nèi)的解離常數(shù)(Kd)都表現(xiàn)出高親和力。因此,適配體也被稱為“化學(xué)抗體”[40]?；诳贵w的篩選方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)點(diǎn),但在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中抗體穩(wěn)定性較差的問題意味著該技術(shù)僅限于高度嚴(yán)格控制的環(huán)境中[41]。具有與抗體相似功能的核酸適配體,因具有成本低、穩(wěn)定性高、易修飾、易合成、不需要活體動(dòng)物或細(xì)胞、反復(fù)使用、可長期保存等優(yōu)點(diǎn),漸漸將抗體取代[42-43]。此外,當(dāng)核酸適配體作為實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)中的模板,可使核酸適配體以指數(shù)形式擴(kuò)增,以大大提高檢測(cè)靈敏度[44]。因此,在許多生物學(xué)應(yīng)用中,核酸適配體被認(rèn)為是抗體的更好替代物[45]。

核酸適配體一般是通過SELEX篩選得到的,其篩選過程是從隨機(jī)寡核苷酸文庫開始,篩選的復(fù)雜度和多樣性取決于其隨機(jī)核苷酸的數(shù)目。在SELEX篩選過程中,隨機(jī)寡核苷酸文庫在pH、離子強(qiáng)度和溫度的作用下暴露于靶標(biāo),與非結(jié)合物分離洗脫,對(duì)靶標(biāo)具有親和性的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后對(duì)從第一輪篩選產(chǎn)生的富集池進(jìn)一步選擇循環(huán),用于增加反應(yīng)池對(duì)靶標(biāo)的親和力(即正篩選)或消除可能與其它相關(guān)化合物交叉反應(yīng)的成員池(即負(fù)篩選)。經(jīng)過數(shù)輪篩選后,對(duì)富集的核苷酸文庫進(jìn)行測(cè)序和表征,通過測(cè)定Kd來評(píng)估適配體的親和力,篩選出高親和力的核酸適配體。在這些序列被測(cè)序之后,可化學(xué)合成大量高純度的目的核酸適配體序列,以便并入感興趣的生物傳感器平臺(tái)中,同時(shí)也可對(duì)靶標(biāo)或者適配體進(jìn)行各種的修飾,以便得到高靈敏、高選擇的核酸適配體生物傳感器[46]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,核酸適配體檢測(cè)技術(shù)在食品安全檢測(cè)、臨床診斷、生物分析以及環(huán)境污染物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,表4列舉了目前文獻(xiàn)中報(bào)道的常見霉菌毒素(AFB1、AFM1、OTA、FB1、ZEN)的核酸適配體序列。

表4 常見的霉菌毒素的核酸適配體序列

3 基于核酸適配體的生物傳感器檢測(cè)食品中霉菌毒素的方法

食品中的霉菌毒素污染一直是全球關(guān)注的問題。近年來由于基于核酸適配體的生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、成本低和便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)被廣泛關(guān)注,目前已有部分核酸適配體檢測(cè)技術(shù)成功應(yīng)用于食品和飼料中霉菌毒素的檢測(cè)。表5列舉了基于核酸適配體的生物傳感器檢測(cè)AFB1、AFM1、OTA、FB1、ZEN的方法。

表5 基于適配體的生物傳感器檢測(cè)霉菌毒素的方法

3.1 在AFB1檢測(cè)中的應(yīng)用

AFB1是毒性最強(qiáng)的霉菌毒素之一,引起了全球食品安全領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。在食品和農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中,時(shí)常發(fā)現(xiàn)AFB1的存在,尤其是在花生、玉米、飼料及谷物作物中[59]。為了使人類健康免受AFB1的危害,許多國家都制定了相關(guān)限量,如歐盟委員會(huì)規(guī)定所有谷類及谷類相關(guān)食品中AFB1含量不超過2 μg/kg[73]。為了阻止污染食品帶來的食品安全恐慌和經(jīng)濟(jì)損失,開發(fā)出快速檢測(cè)AFB1的核酸適配體傳感器顯得極其重要。

Chen等[74]開發(fā)了能快速、靈敏檢測(cè)AFB1的熒光傳感器,首先將將熒光修飾的適配體與其修飾淬滅基團(tuán)的互補(bǔ)DNA雜交,熒光因適配體靠近淬滅基團(tuán)而被淬滅;當(dāng)體系中加入AFB1后,適配體與AFB1結(jié)合形成適配體/AFB1復(fù)合物導(dǎo)致適配體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而釋放cDNA,使適配體恢復(fù)熒光。通過監(jiān)測(cè)熒光值的變化定量分析AFB1的濃度,在優(yōu)化條件下,該方法的檢測(cè)范圍為5～100 ng/mL,檢出限為1.6 ng/mL;該檢測(cè)方法應(yīng)用到不同品牌的嬰幼兒配方米粉中,其回收率為93.0%～106.8%。Sun等[75]開發(fā)了基于適配體表面等離子體共振的生物傳感器,可用于直接定量分析AFB1,首先將鏈霉親和素固定在SPR芯片表面上,然后通過鏈霉親和素與生物素之間強(qiáng)相互作用,捕獲到生物素化的適配體;AFB1與SPR芯片上適配體的結(jié)合導(dǎo)致質(zhì)量濃度發(fā)生變化,進(jìn)而使SPR芯片上有明顯反應(yīng);將適配體固定在SPR芯片表面上,監(jiān)測(cè)AFB1與適配體在SPR芯片上的結(jié)合程度,可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)AFB1的濃度。該方法測(cè)定AFB1的濃度范圍為0.4～200 nmol/L,其檢出限為0.4 nmol/L。在復(fù)雜的樣品基質(zhì)中測(cè)定AFB1,例如稀釋100倍的紅葡萄酒和50倍的啤酒,其檢測(cè)的回收率范圍為87%～102%。該SPR傳感器穩(wěn)定可重復(fù)使用并有實(shí)時(shí)、靈敏度高、特異性強(qiáng)和高通量等優(yōu)點(diǎn)。

Hosseini等[47]開發(fā)了一種以未修飾的金納米顆粒(AuNPs)作為指示劑,AFB1適配體作為特異性識(shí)別元件的比色適配體傳感器,在AuNPs表面上,AFB1結(jié)合適配體產(chǎn)生的解吸作用引起了AuNPs的聚集,使適配體與靶標(biāo)相互作用,導(dǎo)致AuNPs的顏色從紅色變成紫色。該傳感器檢測(cè)AFB1濃度的線性范圍為80～270 nmol/L,檢測(cè)限為7 nmol/L。此外,聚集的AuNPs的催化活性大大增強(qiáng)了化學(xué)發(fā)光反應(yīng),其中檢測(cè)限為0.5 nmol/L,回歸系數(shù)R2=0.9921;該方法對(duì)AFB1檢測(cè)具有較高的靈敏和選擇性,避免了AFB2、AFM1、AFG2、AFG1和OTA等常見霉菌毒素的干擾。Mukherjee等[48]研究了一種以基于AFB1特異性適配體與AFB1半抗原偶聯(lián)物之間的熒光競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)的檢測(cè)方法,可用于快速、靈敏以及高通量檢測(cè)AFB1,在最佳條件下,檢測(cè)的線性范圍為50 pg/mL～50 ng/mL,檢測(cè)限為10 pg/mL;并以干紅辣椒、花生和全椒為例驗(yàn)證該試驗(yàn),在10 ng/mL和100 pg/mL水平下其回收率為92%～102%。

這些檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和高通量等優(yōu)點(diǎn),也為之后適配體傳感器發(fā)展提供了研究和探索的方向,但它們也存在一些不足,比如不能便攜,不能更好地應(yīng)用現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),對(duì)于實(shí)際樣品中的AFB1的檢測(cè)也不具有普遍適用性。所以為了更好的應(yīng)用到實(shí)際生活中,需開發(fā)操作簡(jiǎn)單、便攜、靈敏度更高的適配體傳感器。

3.2 在AFM1檢測(cè)中的應(yīng)用

AFM1是源自肝細(xì)胞色素P450相關(guān)酶活性的AFB1羥基化代謝產(chǎn)物,可從攝入黃曲霉或寄生蟲污染的動(dòng)物性食品的家畜生產(chǎn)的奶或乳制品中發(fā)現(xiàn)[19,64]。在歐洲,牛奶中AFM1的濃度不得超過0.05 μg/kg,中國和美國規(guī)定牛奶中AFM1的濃度必須低于0.5 μg/kg[76-77]。所以開發(fā)出快速、靈敏的適配體傳感器檢測(cè)食品中AFM1極其重要。

Sharma等[78]利用熒光標(biāo)記的AFM1適配體與TAMRA標(biāo)記的互補(bǔ)DNA序列雜交,熒光基團(tuán)和猝滅劑緊密接近導(dǎo)致熒光猝滅。在添加AFM1后,靶向誘導(dǎo)的反平行G-四鏈體適配體-AFM1復(fù)合物構(gòu)象形成導(dǎo)致熒光恢復(fù)。在優(yōu)化條件下,AFM1檢出限為5.0 ng/kg。該檢測(cè)方法已經(jīng)應(yīng)用于加標(biāo)牛奶樣品中AFM1的檢測(cè),回收率為94.40%～95.28%(n=3)。Khoshfetrat等[8]研究了一種用封閉雙極電極(BPE)陣列檢測(cè)AFM1的電化學(xué)發(fā)光(ECL)適配體傳感器,將硫醇化的AFM1適配體固定在金納米顆粒磁性Fe3O4納米顆粒(Apt-GMNPs)上,之后將功能化納米銀修飾的石墨烯氧化魯米諾(GO-L-AgNPs)通過未配對(duì)堿基的π-π相互作用連接到固定適配體(Apt-GMNPs-GO-L-AgNPs)上,將Apt-GMNPs-GO-L-AgNPs引入金陽極BPE陣列后,使各個(gè)電極經(jīng)受不同濃度的AFM1,在AFM1與適配體相互作用后,GO-L-AgNPs從適配體上分離,用光電倍增管(PMT)或智能手機(jī)監(jiān)測(cè)陽極中魯米諾和H2O2的ECL,并用軟件分析圖像,在最佳條件下,基于PMT的BPE-ECL適配體傳感器檢測(cè)在5～150 ng/mL寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,檢測(cè)限為0.01 ng/mL;此外,基于智能手機(jī)的檢測(cè)結(jié)果顯示ECL圖像灰度值與AFM1靶標(biāo)對(duì)數(shù)濃度在10～200 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,檢出限為0.05 ng/mL。

Guo等[79]開發(fā)了一種用于檢測(cè)AFM1的靈敏可靠的適配體傳感器,通過生物素-鏈霉親和素強(qiáng)相互作用使適配體在鏈霉抗生物素包被的PCR管表面上固定,作為PCR擴(kuò)增模板的互補(bǔ)ssDNA與單鏈適配體部分雜交形成dsDNA,dsDNA在無AFM1體系下具有穩(wěn)定性,在添加AFM1后,適配體和AFM1之間的結(jié)合誘導(dǎo)適配體構(gòu)象發(fā)生變化,使互補(bǔ)ssDNA釋放以及模板數(shù)量減少,因此,該適配體傳感器可通過監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增信號(hào)強(qiáng)弱變化定量測(cè)AFM1的濃度;在優(yōu)化條件下,使AFM1濃度在1.0×10-4～1.0 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系,檢測(cè)限低至0.03 ng/L。該方法已成功應(yīng)用于嬰幼兒谷物和奶粉樣品中AFM1的定量測(cè)定。陳璐[25]設(shè)計(jì)了一種基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的熒光適配體傳感器用于檢測(cè)AFM1,用FAM修飾適配體,同時(shí)用TRAMA修飾cDNA。當(dāng)體系中不存在AFM1時(shí),適配體與cDNA雜交,由于適配體與cDNA相互靠近,導(dǎo)致適配體的熒光被淬滅;當(dāng)體系中加入AFM1后,AFM1更易于與適配體結(jié)合,形成AFM1/aptamer復(fù)合物,導(dǎo)致適配體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而釋放cDNA;當(dāng)cDNA遠(yuǎn)離適配體后,適配體熒光恢復(fù);在最優(yōu)條件下,檢測(cè)到的熒光值與AFM1濃度在5～100 ng/mL之間呈線性關(guān)系,檢出限為1.7 ng/mL。

這些檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),但不能更好應(yīng)用到實(shí)際樣品中AFM1的檢測(cè),特別是奶及奶制品。在未來的研究中,需要提高適配體傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的靈敏度,解決因反應(yīng)基質(zhì)的不同導(dǎo)致適配體靈敏度降低的困難。

3.3 在OTA檢測(cè)中的應(yīng)用

OTA對(duì)人體和動(dòng)物具有潛在致癌性,能引起免疫抑制以及免疫毒性,目前由OTA引起的食品污染現(xiàn)象廣泛存在[38]?？紤]到OTA的這些潛在毒性作用,歐盟委員會(huì)明確規(guī)定未加工谷物中OTA的最大限量為5 μg/kg,加工后的谷物為3 μg/kg,咖啡豆為10 μg/kg,葡萄酒為2 μg/mL[80]。為了避免OTA污染的風(fēng)險(xiǎn),檢測(cè)和定量食品及其原料中OTA的含量具有重要意義,所以更加靈敏、快速的檢測(cè)OTA的核酸適配體傳感器不斷被研究出來。

Yue等[67]設(shè)計(jì)一種新型光子晶體編碼懸浮陣列適配體,可同時(shí)量化和鑒定谷類樣品中的OTA和FB1,將適配體通過化學(xué)鍵固定在光子晶體表面,當(dāng)霉菌毒素出現(xiàn)在樣品中時(shí),適配體熒光標(biāo)記的互補(bǔ)DNA從雙鏈DNA雜交體中解離,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度明顯下降;該傳感器以二氧化硅光子晶體微球(SPCM)的熒光強(qiáng)度差值定量霉菌毒素的濃度,再以SPCM的顏色或反射峰位置確定了霉菌毒素種類;該方法檢測(cè)的OTA范圍為0.01～1 ng/mL,檢測(cè)限為0.25 pg/mL,加標(biāo)谷物樣品中OTA的回收率為81.80%～116.38%。Sun等[81]利用無固定化適配體-氧化石墨烯納米片與基于DNA酶I的循環(huán)信號(hào)放大相耦合的特點(diǎn),開發(fā)了一種簡(jiǎn)單可行的用于檢測(cè)食品中OTA的均相電化學(xué)傳感器;氧化石墨烯納米片與核堿基和芳族化合物的非共價(jià)結(jié)合使硫堇標(biāo)記的OTA適配體附著于納米片的表面,再以帶負(fù)電的絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)獲得的游離硫堇分子為電子信號(hào);由于形成的硫蛋白適配體/石墨烯納米復(fù)合物懸浮在檢測(cè)溶液中并遠(yuǎn)離電極,從而導(dǎo)致電子信號(hào)變?nèi)?當(dāng)添加OTA后,分析物與適配體反應(yīng)并導(dǎo)致硫氧還原蛋白-適配體從氧化石墨烯納米片上解離;新形成的硫代-適配體/OTA容易被DNase I切割并釋放出OTA,可重新觸發(fā)硫堇-適配體/石墨烯納米復(fù)合物,并產(chǎn)生大量游離硫堇分子;游離的硫堇分子被負(fù)電荷的SPCE捕獲,每個(gè)分子都可以在施加電位內(nèi)產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào);通過監(jiān)測(cè)電流的變化,定量評(píng)估樣品中OTA的濃度;在最佳條件下,該傳感器檢測(cè)限為5.6 pg/mL。

Samokhvalov等[82]提出了一種以適配體為受體,以錨蛋白為模板作為增強(qiáng)子的熒光偏振適配體傳感器,這種方法利用增加結(jié)合和未結(jié)合熒光團(tuán)的尺寸差異,通過熒光標(biāo)記和游離的OTA與適配體之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定OTA;由于熒光標(biāo)記的OTA與包含在錨定復(fù)合物中適配體的結(jié)合比與游離適配體結(jié)合產(chǎn)生了更高的偏振,這使得該傳感器檢測(cè)限降低至3.6 nmol/L,并能在15 min內(nèi)完成測(cè)定;為了評(píng)估該方法對(duì)實(shí)際樣品的具有適用性,在加標(biāo)白葡萄酒中檢出限為2.8 nmol/L,回收率為83%～113%。Modh等[83]開發(fā)了一種以適配體為輔助的基于實(shí)時(shí)PCR的靶向誘導(dǎo)解離方法;通過將OTA適配體固定在涂有d(T)25的磁珠(dT磁珠)上,并與適配體中OTA結(jié)合部分的互補(bǔ)序列用作dT磁珠和適配體序列之間的接頭,將適配體固定在dT磁珠上;當(dāng)添加OTA時(shí),由于靶向誘導(dǎo)解離作用,使適配體從dT磁珠中釋放,通過qPCR擴(kuò)增定量適配體;該檢測(cè)方法的濃度范圍為0.039～1000 ng/mL,檢測(cè)限為0.009 ng/mL。Apta-qPCR檢測(cè)方法具有靈敏、穩(wěn)定和選擇性,可用于檢測(cè)復(fù)雜樣品等優(yōu)點(diǎn)。

目前研發(fā)的用于食品中OTA檢測(cè)的適配體傳感器種類繁多且操作簡(jiǎn)單,并具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,如結(jié)合血糖儀檢測(cè)食品中OTA[84]。不過主要問題仍是在改變反應(yīng)基質(zhì)后,傳感器靈敏度降低,所以這也是今后研究的關(guān)注點(diǎn)之一。

3.4 在FB1檢測(cè)中的應(yīng)用

FB1是伏馬毒素B系列中毒性最大的,可引起人體肝臟疾病和食道癌[85]。因此需要高靈敏、便捷、簡(jiǎn)單的方法用于食品中FB1的檢測(cè)。Ren等[86]開發(fā)了一種一次性適配體傳感器裝置,將預(yù)處理的SPCE用帶孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜覆蓋,以構(gòu)建具有常規(guī)三電極的微電池,之后在工作中的電極上電沉分散良好的金納米顆粒,作為硫醇化適配體固定的優(yōu)良基質(zhì);由于單個(gè)金納米顆?？梢匝b載大量對(duì)FB1特異性的硫醇化適配體,因此在SPCE上修飾AuNPs為適配體提供了豐富的結(jié)合位點(diǎn),從而提供了一個(gè)3D感應(yīng)界面,有效地提高了響應(yīng)信號(hào);在最佳條件下,FB1濃度與EIS信號(hào)在10 pg/mL～50 ng/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為3.4 pg/mL(S/N=3)。該傳感器裝置具有成本低、操作簡(jiǎn)單、高靈敏度和試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。

Chen等[87]通過電化學(xué)阻抗譜開發(fā)了一種基于適配體的生物識(shí)別方法,將FB1的硫醇化適配體錨定在玻碳電極上的金納米顆粒表面;當(dāng)FB1濃度為0.1 nmol/L～100 μmol/L,FB1濃度與電阻數(shù)值呈線性關(guān)系,且檢測(cè)限為2 pmol/L;該測(cè)定法可用于加標(biāo)玉米樣品中FB1的測(cè)定,回收率為91%～105%。桂海孌等[88]利用非標(biāo)記熒光染料PicoGreen特異性識(shí)別適配體,建立了一種快速、高效檢測(cè)FB1的方法,利用適配體的選擇性以及PicoGreen與雙鏈DNA結(jié)合的特異性,通過熒光信號(hào)變化確定樣品中FB1濃度,實(shí)現(xiàn)了快速定量檢測(cè)FB1的目的;整個(gè)檢測(cè)流程可在40 min內(nèi)完成,線性范圍為0.1～1μg/L,檢測(cè)限為0.1 μg/L。Yue等[67]設(shè)計(jì)了一種以適配體為基礎(chǔ)并由光子晶體編碼的懸浮陣列,可同時(shí)定量和定性檢測(cè)OTA和FB1。該方法對(duì)FB1的檢測(cè)范圍為0.001～1 ng/mL,檢測(cè)限為0.16 pg/mL,加標(biāo)谷物樣品中FB1的回收率為76.58%～114.79%。

這些傳感器具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和親和力高等優(yōu)點(diǎn),其中研發(fā)的同時(shí)檢測(cè)兩種霉菌毒素的適配體傳感器對(duì)之后同時(shí)檢測(cè)多種霉菌毒素的傳感器的發(fā)展提供了新的探索思路和方向。

3.5 在ZEN檢測(cè)中的應(yīng)用

ZEN是由鐮刀菌產(chǎn)生的非甾體雌激素霉菌毒素,可導(dǎo)致DNA損傷和染色體失常,并引起牛、豬和家禽等動(dòng)物的生殖問題,甚至導(dǎo)致人類的生殖問題[85,89]。目前檢測(cè)食品中玉米赤霉烯酮的主要方法是儀器分析,該檢測(cè)方法不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),所以更需研發(fā)出高靈敏、簡(jiǎn)便和快速的方法檢測(cè)食品中的ZEN。

Wu等[71]報(bào)道了一種基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs)和磁性納米粒子(MNPs)的適配體傳感器,用于定量檢測(cè)ZEN。將適配體及其cDNA固定在MNP和UCNP表面上來制備發(fā)光生物測(cè)定平臺(tái),然后將aptamer-MNPs和cDNA-UCNPs混合形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。當(dāng)添加ZEN,適配體從cDNA上解離并優(yōu)先結(jié)合ZEN,導(dǎo)致發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度降低。結(jié)果表明,該檢測(cè)方法的檢測(cè)限為0.25 μg/L,在0.05～100 μg/L范圍內(nèi)信號(hào)發(fā)光強(qiáng)度與ZEN濃度呈顯著的線性相關(guān)性(R2=0.9957)。Chen等[57]開發(fā)了一種基于磁珠分離/富集的簡(jiǎn)單而快速的SELEX檢測(cè)方法。將ZEN包被的磁珠與ssDNA(0～1600 nmol/L)溫育60 min進(jìn)行結(jié)合測(cè)定。通過熱處理洗脫磁珠結(jié)合的適配體,并測(cè)量ssDNA的濃度。經(jīng)過14輪SELEX,篩選出最佳適配體并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品中ZEN的檢測(cè)。該檢測(cè)方法對(duì)ZEN的線性范圍為3.14×10-9～3.14×10-5mol/L,檢測(cè)限為0.785 nmol/L。

Wang等[58]通過利用單鏈DNA適配體和ZEN單克隆抗體(mAb-ZEN)具有高特異性和親和性的特點(diǎn),開發(fā)了一種用于檢測(cè)玉米中ZEN的低氧免疫吸附測(cè)定方法。通過將純化的mAb-ZEN作為ssDNA識(shí)別的靶標(biāo),并包被在微量滴定板上。經(jīng)過15輪篩選,獲得了對(duì)mAb-ZEN有最高親和力和特異性的適配體。該檢測(cè)方法的檢出限為0.01 ng/mL,檢測(cè)范圍為0.03～2.5 ng/mL,加標(biāo)樣品的回收率為95%～105%。Goud等[72]開發(fā)了一種以功能性的氧化石墨烯作為FAM熒光猝滅劑為基礎(chǔ)的適配體傳感器方法。該方法測(cè)定ZEN的濃度范圍為0.5～64 ng/mL,檢測(cè)限為0.5 ng/mL。并成功地應(yīng)用于測(cè)定加標(biāo)的酒精飲料、啤酒和葡萄酒中ZEN,回收率為87%～96%,濃度范圍為1～16 ng/mL。目前對(duì)于ZEN適配體傳感器的研發(fā)較少,主要難題是篩選ZEN的適配體數(shù)目較少,對(duì)ZEN適配體傳感器的發(fā)展具有一定的局限性。

目前研發(fā)的ZEN適配體傳感器雖然靈敏度高、特異性高,但存在檢測(cè)操作繁雜,操作時(shí)間長等缺點(diǎn)。所以ZEN適配體傳感器的研究具有很大的發(fā)展空間。

4 結(jié)語與展望

近年來核酸適配體檢測(cè)方法的發(fā)展證明了核酸適配體檢測(cè)技術(shù)可作為取代食品中檢測(cè)霉菌毒素的常規(guī)檢測(cè)和分析方法,對(duì)于食品中其他小分子有害物質(zhì)的檢測(cè)提供了新的思路和途徑。核酸適配體因具有易合成、易標(biāo)記、易修飾、靈敏度高、特異性高等優(yōu)點(diǎn),使其在食品安全、醫(yī)學(xué)檢測(cè)、藥物分析和疾病診斷等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。目前核酸適配體廣泛應(yīng)用于檢測(cè)霉菌毒素、金屬離子、微生物、蛋白質(zhì)等目標(biāo)物,而大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道都以AFB1、AFM1、OTA和FB1為主,其他霉菌毒素核酸適配體的文獻(xiàn)報(bào)道幾乎沒有,所以篩選出其他霉菌毒素適配體及研發(fā)出相關(guān)適配體生物傳感器具有一定的挑戰(zhàn)性。

目前,已經(jīng)開發(fā)出用于霉菌毒素的核酸適配體傳感器包括基于比色、熒光和PCR方法的傳感器[28,59,61],也存在耗時(shí)且不易執(zhí)行的缺點(diǎn),而且有些傳感器在使用時(shí)仍需要修改儀器的檢測(cè)步驟,導(dǎo)致操作步驟繁瑣,也存在損壞儀器的可能。在檢測(cè)食物樣品中霉菌毒素時(shí),檢測(cè)體系中的反應(yīng)基質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響適配體靈敏度和準(zhǔn)確性,特別是在測(cè)定食品中多種霉菌毒素時(shí)。通過簡(jiǎn)化的樣品制備過程來降低基質(zhì)效應(yīng),這也是核酸適配體檢測(cè)食品中霉菌毒素面臨的挑戰(zhàn)和今后發(fā)展的趨勢(shì)。盡管多數(shù)霉菌毒素核酸適配體已經(jīng)得到應(yīng)用,如試紙條,結(jié)合血糖儀檢測(cè)等,將這些核酸適配體作為實(shí)際應(yīng)用的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工具仍有一定的難度,對(duì)于未來快速檢測(cè)食品中霉菌毒素提供了新的思路和挑戰(zhàn)。未來的研究可能集中研發(fā)便攜、親和力高、成本效益高的核酸適配體傳感器,使這些方法更適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。