趙 丹,張婷婷,2,彭春秀,龔加順,*

(1.云南農業(yè)大學食品科學技術學院,云南昆明 650201;2.文山學院(化學與工工程學院),云南文山 663000;3.云南農業(yè)大學園林園藝學院,云南昆明 650201)

普洱茶是我國特有的茶葉種類,最早產(chǎn)于我國云南省思茅地區(qū)和西雙版納地區(qū),歷史悠久,具有獨特的風味和品質特征。云南普洱茶被稱為歷史名茶,以地理標志保護范圍內的云南大葉種曬青茶為原料,并采用特定的固態(tài)發(fā)酵加工工藝制成[1]。茶葉是廣受全球消費者喜愛的三大無酒精飲品之一[2]。作為一種綠色、自然、健康的飲品出現(xiàn)在日常生活中,同時由于茶葉具有降血脂、抗動脈硬化等保健功能受到消費者的喜愛,而茶葉中的成分也成為研究者關注的熱點。其中茶葉的化學成分主要包括茶多酚、茶色素、蛋白質、茶多糖等[3]。

普洱茶茶色素主要活性成分茶褐素(Theabrownins,TB)是在普洱茶發(fā)酵過程中形成的[4],茶褐素是形成普洱茶獨特口味和色澤的重要物質,具有顯著的抗疲勞和降血脂效果,因此,茶褐素被認為是普洱茶重要的特征性成分。茶褐素是茶葉中以兒茶素為主的多酚類化合物氧化聚合而成的大分子水溶性色素,易溶于水,但不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷等有機溶劑的高聚合物質[5]。茶褐素具有減肥、調節(jié)血脂異常、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等作用,在普洱熟茶中茶褐素含量平均為12%[5-12]。茶褐素含量的高低是區(qū)別普洱茶的品質的關鍵因素[13]。

張婷婷等[14]前期研究也發(fā)現(xiàn)63 d干預期結束后,與高糖模型組相比,茶褐素組能抑制高糖飲食大鼠體重、體脂的增加,不同程度地抑制了大鼠血清甘油三酯、空腹血糖的升高,尤其是高劑量茶褐素組效果顯著(p<0.05),茶褐素具有抑制高糖飲食大鼠血糖升高及體重增加的功效。本研究旨在觀察普洱茶茶褐素對高糖飲食大鼠糖脂代謝途徑的多種關鍵酶活性指標及肝臟組織和胰腺組織切片的影響,為揭示普洱茶茶褐素調節(jié)糖脂代謝機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SPF級SD大鼠60只,體重(160±20) g 昆明醫(yī)科大學實驗動物中心,許可證編號[SCXK(滇)K2015-0002];鳳慶牌普洱茶熟茶 云南春茗茶業(yè)有限責任公司,產(chǎn)品標準(GB/T 14456.2-2008;生產(chǎn)日期:2012年);無水乙醇 天津市風船化學試劑科技有限公司;無水乙醚 天津市化學試劑三廠;馬來酸羅格列酮 上海源葉生物科技有限公司;所用試劑 均為分析純;空腹胰島素(Fasting insulin,FINS)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)、葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)、硬脂酰輔酶A脫氫酶-1(Stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1)、羥甲基戊二酰輔酶A(Hydroxy-methyl-glutarylcoenzymeA,HMG-COA)、激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitivelipase,HSL)、脂肪酸輔酶A連接酶(Fatty-acid-CoAligase,FACL)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase,FAS)、游離脂肪酸(Free fatty acids,FFA)、脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LPL)、乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase,ACC)、肉堿棕櫚酰轉移酶-Ⅰ(Carnitinepalmitoyltransterase-Ⅰ,CPT-Ⅰ)、肉堿棕櫚酰轉移酶-Ⅱ(Carnitinepalmitoyltransterase-Ⅱ,CPT-Ⅱ)、瘦素(Leptin,LEP)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素-1(Interleukin-1,ILl-1)、白細胞介素-6(Interleukin-6,ILl-6)測定試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司;動物飼料 昆明醫(yī)科大學動物實驗中心,基礎飼料主要成分為玉米、麥麩和豆粨,高糖飼料配方:85%的基礎飼料,15%蔗糖。

OlympusAU5421型全自動生化儀 日本Olympus;ELX 808型酶標儀 美國伯騰公司;Forma902-80 ℃冰箱 Thermo Fisher Scientific;BS210S型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;RM2016型切片機 德國萊卡;KD-T型攤烤片機 浙江省金華市科迪儀器設備有限公司;OLYMPUS CHC型光學顯微鏡 日本OLYMPUS光學工業(yè)株式會社產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 普洱茶茶褐素的制備 普洱茶熟茶→10倍蒸餾水(95 ℃)浸提2次,每次30 min→過濾→合并濾液→減壓濃縮(65 ℃,0.07 MPa)→乙醇(濾液∶無水乙醇=1∶4,V/V)醇沉6 h→離心(4000 r/min,20 min)→收集沉淀→蒸餾水溶解→真空冷凍干燥→粗茶褐素(供試樣,茶褐素含量:75.3%)[12,15-16]。

1.2.2 大鼠分組及喂養(yǎng)方法 實驗大鼠在空調動物飼養(yǎng)室中同室群籠喂養(yǎng),自由進食和飲水,房間溫度為20～25 ℃,濕度為45%～60%,12 h光照明暗交替。60只實驗大鼠基礎飼料適應喂養(yǎng)7 d后,進行稱重和測定血清總膽固醇、血清甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖。根據(jù)體重、血清總膽固醇、血清甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖值無顯著性差異的大鼠分成正常對照組、高糖模型組、茶褐素低、中、高劑量組及陽性(羅格列酮)對照組,每組10只大鼠,進行為期63 d的干預期。正常對照組飼喂正常飼料和飲用蒸餾水,其余各組飼喂高糖飼料和飲用15%的果糖水,其中不同劑量組按照設定的劑量每日經(jīng)口灌胃茶褐素,陽性對照組每日經(jīng)口灌胃羅格列酮,其他組別均給予相同劑量蒸餾水灌胃。

茶褐素灌胃劑量:龔加順等[17]研究發(fā)現(xiàn),受試物的 LD50>10 g/kg(95%可信限),屬實際無毒級物質。敬明武等[18]報道茶色素的人體推薦量為每60 kg體質量2.7 g。根據(jù)“動物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表”來計算大鼠灌胃的劑量,按照1、2、4倍設計低、中、高三個劑量組,即灌胃劑量為0.281、0.562、1.124 g/kg·bw[14];健康成人一次口服羅格列酮片4 mg,最大推薦劑量為每日8 mg,每日一次或分2次口服本實驗選取人體最大劑量8 mg,即0.13 mg/kg·bw作為羅格列酮對照組大鼠的灌胃劑量[14]。

1.2.3 指標測定 每日觀察大鼠活動情況及皮毛狀況,記錄動物死亡情況,每天記錄大鼠的攝食量,每周稱量大鼠體重。

動物喂養(yǎng)至63 d,禁食12 h后眼眶采血,3000 r/min低速離心機上離心15 min分離血清,吸取上清于-20 ℃保存,待測。測定血清中FINS、PK、GK、SCD-1、HMG-COA、HSL、FACL、FAS、FFA、LPL、ACC、CPT-Ⅰ、CPT-Ⅱ、LEP、TNF-α、ILl-1、ILl-6活性,嚴格按照上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供的大鼠酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書進行。

1.2.4 肝臟和胰腺病理切片的制備 干預63 d后,大鼠脫頸椎處死,摘取新鮮胰腺和肝臟組織,肝臟組織稱重后,從最大葉距邊緣5 mm處取肝臟組織,并固定于10%的甲醛溶液中,脫水,石蠟包埋,切片,HE(蘇木精-伊紅染色)染色,電子顯微鏡觀察[19-20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計分析及統(tǒng)計圖制作分別在SPSS 19.0及Excel 2003上完成。計量資料以“均數(shù)±標準差”表示,所有數(shù)據(jù)先進行Grubbs檢驗,以排除過失誤差,組間比較采用t檢驗,以p<0.05為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 普洱茶茶褐素對高糖飲食大鼠糖脂代謝關鍵酶活性的影響

2.1.1 FINS、HOMA-IR、HOMA-IS、HOMA-β關鍵指標的影響 由表1可看出,干預期63 d時,高糖模型組的FINS、HOMA-IR水平顯著高于正常對照組(p<0.05),表明高糖飲食可以誘發(fā)大鼠的血清空腹胰島素顯著升高;陽性對照組、TB低、中、高劑量組與正常對照組的FINS、HOMA-IR水平均無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組與高糖模型組相比FINS分別降低18.30%、20.45%、21.62%、22.80%,在一定范圍內,灌胃劑量越高,對預防高糖飲食大鼠FINS水平的升高效果越好;陽性對照組、TB低、中、高劑量組大鼠與高糖模型組相比HOMA-IR分別降低了18.26%、11.08%、18.86%、26.35%;表明大鼠飼喂高糖飼料,飲用15%果糖水的同時給予灌胃普洱茶茶褐素可預防高糖飲食大鼠HOMA-IR水平的升高(p<0.05),且灌胃中劑量普洱茶茶褐素與灌胃羅格列酮對預防高糖飲食大鼠HOMA-IR水平升高的效果相似。

表1 普洱茶茶褐素對高糖飲食大鼠血清胰島素關鍵指標的影響Table 1 Effect of TB extracted from pu-erh tea on the insulin and related index in ratswith high sugar diet

干預63 d后,高糖模型組的HOMA-IS指數(shù)顯著低于正常對照組(p<0.05),TB高劑量組與正常對照組、陽性對照組和TB低、中劑量組的HOMA-IS指數(shù)相比均無顯著性差異(p>0.05),陽性對照組和TB低、中、高劑量組大鼠與高糖模型組相比HOMA-IS水平分別升高了19.35%、12.90%、19.35%、32.26%;表明大鼠飼喂高糖飼料,飲用15%果糖水同時給予灌胃普洱茶茶褐素可預防高糖飲食大鼠HOMA-IS水平的降低,且灌胃中劑量普洱茶茶褐素與灌胃羅格列酮對預防高糖飲食大鼠HOMA-IS水平升高的效果相似。

干預63 d后,高糖型組的HOMA-β指數(shù)顯著低于正常對照組(p<0.05);陽性對照組、TB中、高劑量組與正常對照組的HOMA-β指數(shù)相比均無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組和TB低、中、高劑量組大鼠HOMA-β水平與高糖模型組相比HOMA-β水平各升高了17.51%、4.63%、17.75%、24.15%;表明大鼠飼喂高糖飼料,飲用15%果糖水同時給予灌胃普洱茶茶褐素預防高糖飲食大鼠HOMA-β水平的降低,且灌胃中劑量普洱茶茶褐素與灌胃羅格列酮對預防高糖飲食大鼠HOMA-β水平升高的效果相似。

2.1.2 PK、GK、SCD、HMG-COA、HSL關鍵酶活性的影響 由表2可看出,干預63 d后,高糖模型組的PK活性顯著低于正常對照組(p<0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組的PK活性與正常對照組、高糖模型組相比均無顯著性差(p>0.05),其中陽性對照組、TB低、中、高劑量組與高糖模型組相比PK活性分別升高了8.86%、3.47%、7.87%、18.12%,表明大鼠飼喂高糖飼料,飲用15%果糖水的同時給予灌胃普洱茶茶褐素可增加大鼠血清的PK水平,且在一定范圍內,灌胃劑量越高,對增加高糖飲食大鼠PK水平的升高效果越好。

表2 普洱茶茶褐素對高糖飲食大鼠血清PK、GK、SCD、HMG-COA、HSL酶活性的影響Table 2 Effect of TB extracted from pu-erh tea on serum PK,GK,SCD,HMG-COA,HSL enzyme activity in rats with high sugar diet

干預63 d后,高糖模型組的GK活性顯著低于正常對照組(p<0.05);陽性對照組、TB低、中劑量組的GK活性顯著低于正常對照組(p<0.05),高劑量與正常對照無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組、TB低、中劑量組與高糖模型組相比無顯著性差異(p>0.05),高劑量組顯著高于高糖模型組(p<0.05),其中陽性對照組、TB低、中、高劑量組與高糖模型組相比，GK活性升高了5.38%、2.20%、3.03%、21.98%，表明大鼠飼喂高糖飼料,飲用15%果糖水的同時給予灌胃普洱茶茶褐素可增加大鼠血清的GK水平,且在一定范圍內,灌胃劑量越高,對增加高糖飲食大鼠GK水平的升高效果越好。

干預63 d后,高糖模型組的SCD-1水平顯著高于正常對照組(p<0.05);TB中、高劑量組的SCD-1水平顯著高于高糖模型組,并顯著低于陽性對照組和高糖模型組(p<0.05);表明大鼠飼喂高糖飼料的同時給予灌胃普洱茶茶褐素可抑制SCD-1的活性,且在一定范圍內,灌胃劑量越高,對抑制高糖飲食大鼠SCD-1水平的升高效果越好。

干預63 d后,高糖模型組的HMG-COA還原酶活性顯著高于正常對照組(p<0.05);陽性對照組、TB高劑量組與正常對照組無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組和TB低、中、高劑量組與高糖模型組相比分別降低了25.02%、0.35%、10.72%、25.61%;表明大鼠飼喂高糖飼料,飲用15%果糖水的同時同時給予灌胃普洱茶茶褐素可抑制HMG-CoA還原酶的活性。

干預63 d后,高糖模型組的HSL水平顯著高于正常對照組(p<0.05),陽性對照組、TB低、中、高劑量組大鼠的HSL水平與正常對照組和高糖模型組相比均無顯著性差異(p>0.05)。

2.1.3 FACL、FAS、FFA、LPL關鍵酶活性的影響 由表3可知,干預63 d后,高糖模型組的FACL活性顯著低于正常對照組(p<0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組與正常對照組無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組顯著高于高糖飲食對照組(p<0.05),分別升高了13.18%、12.73%、14.48%、15.36%,表明大鼠飼喂高糖飼料會降低大鼠血清FACL活性。

表3 普洱茶茶褐素對高糖飲食大鼠血清FACL、FAS、FFA、LPL酶活性的影響Table 3 Effect of TB extracted from pu-erh tea on serum FACL,FAS,FFA,LPL enzyme activity in rats with high sugardiet

干預63 d后,高糖模型組大鼠的FFA水平顯著高于正常對照組(p<0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組與正常對照組無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組與高糖模型組相比分別降低了13.38%、7.60%、12.90%、15.64%,表明大鼠飼喂高糖飼料,飲用15%果糖水的同時給予灌胃普洱茶茶褐素可抑制大鼠血清的FFA水平。且在一定范圍內,灌胃劑量越高,對抑制高糖飲食大鼠FFA水平的升高效果越好。

干預63 d后,高糖模型組大鼠的FAS、LPL活性顯著高于正常對照組(p<0.05);陽性對照組、TB低、中量組FAS水平顯著高于正常對照組(p<0.05),高劑量組與正常對照組無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組大鼠的FAS活性與高糖模型組相比各降低了6.28%、2.18%、7.41%、10.29%;表明大鼠飼喂高糖飼料的,飲用15%果糖水的同時給予灌胃普洱茶茶褐素可抑制FAS的活性,且在一定范圍內,灌胃劑量越高,對抑制高糖飲食大鼠FAS水平的升高效果越好。除高糖模型組外其他各組LPL水平與正常對照組無明顯差異,陽性對照組、TB低、中、高劑量組大鼠的LPL活性與高糖模型組相比各降低了6.28%、2.18%、7.41%、10.29%;表明大鼠飼喂高糖飼料,飲用15%果糖水的同時給予灌胃普洱茶茶褐素可抑制大鼠血清中LPL水平的升高。

2.1.4 LEP、ACC、CPT-Ⅰ、CPT-Ⅱ關鍵酶活性的影響 由表4可知,干預63 d后,高糖模型組的LEP水平顯著高于正常對照組(p<0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組與正常對照組無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組與高糖模型組相比分別降低了11.07%、6.58%、9.69%、12.11%;表明大鼠飼喂高糖飼料,飲用15%果糖水的同時給予灌胃普洱茶茶褐素可抑制大鼠血清的LEP水平,且在一定范圍內,灌胃劑量越高,對抑制高糖飲食大鼠LEP水平的升高效果越好。

表4 普洱茶茶褐素對高糖飲食大鼠血清ACC、CPT-Ⅰ、CPT-Ⅱ、LEP酶活性的影響Table 4 Effect of TB extracted from pu-erh tea on serum ACC,CPT-Ⅰ,CPT-Ⅱ,LEP enzyme activity in rats with high sugar diet

干預63 d后,高糖模型組的ACC、CPT-Ⅰ、CPT-Ⅱ水平與正常對照組無顯著性差異(p>0.05)。表明大鼠飼喂高糖飼料,同時飲用15%果糖水的對大鼠的ACC、CPT-Ⅰ、CPT-Ⅱ水平無明顯影響。

2.1.5 TNF-α、IL-1β、IL-6關鍵炎癥因子酶活性的影響 由表5可知,干預期63 d后,高糖模型組的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著高于正常對照組(p<0.05)。除高糖模型組外,其余各組TNF-α水平與正常對照組均無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組與高糖模型組相比，TNF-α水平分別降低了15.94%、9.54%、11.31%、16.66%和;陽性對照組、TB中、高劑量組與正常對照組血清的IL-1β水平無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組、TB中、高劑量組與高糖模型組血清的IL-1β水平有顯著性差異(p<0.05),分別降低了7.50%、6.94%、8.47%、13.30%。陽性對照組、TB低、中、高劑量組與正常對照組血清的IL-6水平無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組、TB低、中、高劑量組大鼠血清的IL-6水平與高糖模型組相比各降低了3.62%、1.39%、3.55%、4.60%;表明大鼠飼喂高糖飼料的,飲用15%果糖水的同時給予灌胃普洱茶茶褐素可抑制大鼠血清的TNF-α、IL-1β和IL-6水平。且在一定范圍內,灌胃劑量越高,對抑制高糖飲食大鼠血清的TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高效果越好。

表5 普洱茶茶褐素對高糖飲食大鼠血清關鍵炎癥因子的影響Table 5 Effect of TB extracted from pu-erh tea on the activity of serum key inflammatory factor in rats with high glucose diet

2.2 普洱茶茶褐素對高糖飲食大鼠肝臟切片的影響

由圖1可看出,HE染色光鏡下顯示正常對照組(圖1A)大鼠肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列,形態(tài)正常;高糖模型組(圖1B)大鼠肝細胞有一定病理改變,但不是很典型。說明一定條件下高糖飲食對大鼠肝臟病理性影響。灌胃不同劑量普洱茶茶褐素組(圖1D、E、F),大鼠肝細胞排列整齊,形態(tài)正常。說明普洱茶茶褐素可以降低高糖飲食大鼠肝臟脂質沉積。

圖1 普洱茶茶褐素對大鼠肝臟切片的影響

2.3 普洱茶茶褐素對高糖飲食大鼠胰腺切片的影響

由圖2可知,HE染色光鏡下顯示正常對照組(圖2A)胰腺腺泡及胰島結構完好,胰島多成圓形或橢圓形,細胞形態(tài)正常,未見炎癥反應。高糖模型組(圖2B)大鼠出現(xiàn)胰腺腺泡減少,胰島細胞萎縮,部分胰島形態(tài)不規(guī)則。羅格列酮對照組(圖2C)胰腺腺泡略減少,部分病例胰島細胞萎縮(2/5),部分病例胰島細胞增生(2/5)。低劑量TB組(圖2D)胰腺腺泡減少,胰島細胞萎縮,胰島形態(tài)不規(guī)則,近似于高糖模型組。中劑量TB組(圖2E)胰腺腺泡減少,胰島細胞萎縮,胰島形態(tài)不規(guī)則。高劑量TB組(圖2)胰腺腺泡略有減少,胰島細胞萎縮,但胰島形態(tài)較規(guī)則,個別病例見少量炎癥細胞浸潤。說明普洱茶茶褐素可以降低高糖飲食大鼠胰島損害的程度,預防高血糖癥的發(fā)生,且與劑量呈正相關。

圖2 普洱茶茶褐素對大鼠胰腺切片的影響

3 結論

動物造模實驗研究證實,高脂飲食模型以膽固醇升高為主[21],高糖飲食模型以TG升高為主。不同的飲食結構會對血脂的成分造成不同的影響,現(xiàn)今我國飲食主要以高糖為主[22],張婷婷等[14]前期研究顯示,本實驗動物模型TG顯著升高(p<0.05),與報道一致,故高糖模型組造模成功。

在飼喂高糖飲食,飲用15%的果糖水的同時給予灌胃普洱茶茶褐素,高糖飲食條件能夠增加大鼠體重、體脂、血清甘油三酯、空腹血糖的升高,能夠有效抑制腎周脂肪的增加[14]。本實驗研究也發(fā)現(xiàn)與高糖模型組相比,茶褐素能有效地抑制高糖飲食大鼠FINS、HOMA-IR、LPL、SCD-1、FAS、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的升高;其中TB低、中、高劑量組不同程度降低HOMA-β、HSL、FFA、LEP水平,能有效增加高糖飲食大鼠GK、HMG-COA、HOMA-IS水平,增加PK、FACL水平;高糖飲食對大鼠血清ACC、CPT-Ⅰ、CPT-Ⅱ水平無顯著影響(p>0.05);大鼠肝臟和胰腺HE染色后,在顯微鏡下觀察高糖模型組都有一定程度的病變,灌胃茶褐素后能得到改善,說明普洱茶茶褐素可以降低高糖飲食大鼠肝臟脂質沉積,可以降低高糖飲食大鼠胰島損害的程度,預防高血糖癥的發(fā)生。

本實驗結果為茶褐素調節(jié)糖脂代謝提供科學依據(jù),但本次研究只局限于生理表層和關鍵酶活性表達方面,將來更需要通過蛋白質組學和代謝組學等實驗進行對降血糖機制進一步評價分析,為茶褐素調節(jié)糖脂代謝機理提供進一步的理論幫助。