陳一民，徐 欣，侯 萌，張錦源，周 珂，焦曉光，隋躍宇

(1.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081；2.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

0 引 言

纖維素是植物體的重要組成部分，占植物干重的50%左右[1-2]，是地球上十分重要的生物量，其分解與轉(zhuǎn)化對(duì)土壤碳循環(huán)具有重要的意義[3]。土壤中的纖維素在纖維素酶的作用下，逐步分解成葡萄糖，為微生物提供碳源，纖維素酶活性可以反映土壤中微生物對(duì)纖維素的分解能力[4]。β-葡糖苷酶是纖維素水解過(guò)程中催化纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的酶，其活性直接限制纖維素的水解[2]，并對(duì)潛在的微生物酶活性有一定的促進(jìn)作用[5]。因此，研究纖維素酶活性和β-葡糖苷酶活性，對(duì)認(rèn)識(shí)土壤微生物纖維素分解能力以及纖維素分解限制過(guò)程具有重要的意義。

土壤酶活性受土壤有機(jī)質(zhì)含量、溫度和施肥等多種環(huán)境因素的直接影響[6-7]。已有研究表明，纖維素酶和β-葡糖苷酶活性均隨土壤有機(jī)質(zhì)含量升高而增強(qiáng)[8-10]，但這些研究大部分都是側(cè)重于纖維素酶和β-葡糖苷酶活性對(duì)不同施肥處理造成的土壤有機(jī)質(zhì)梯度的響應(yīng)，目前關(guān)于自然有機(jī)質(zhì)梯度下纖維素酶和β-葡糖苷酶活性與土壤有機(jī)質(zhì)含量之間關(guān)系的研究報(bào)道較少。溫度是影響土壤酶活性的一個(gè)重要因子，一般來(lái)講，隨溫度升高，纖維素酶和β-葡糖苷酶活性也升高[11-12]，但也有研究表明，溫度升高對(duì)土壤酶活性有抑制作用或無(wú)明顯作用[13-15]。酶活性對(duì)溫度響應(yīng)的研究多集中在森林生態(tài)系統(tǒng)[13-15]，在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的研究較少，纖維素酶和β-葡糖苷酶活性在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)溫度的響應(yīng)亟待進(jìn)一步研究。此外，目前關(guān)于施肥對(duì)土壤酶活性的影響研究較多，大部分研究表明施肥能夠提高土壤酶活性[10,16-17]，如纖維素酶和β-葡糖苷酶[9,17]；但也有一些研究指出，施肥會(huì)通過(guò)改變土壤理化性質(zhì)來(lái)改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生一定的抑制作用[9]，長(zhǎng)期施用化肥對(duì)農(nóng)田黑土中纖維素酶和β-葡糖苷酶的影響需要進(jìn)一步明確。我國(guó)東北黑土區(qū)南北縱跨1 400 km，東西橫跨1 600 km，土壤有機(jī)質(zhì)含量變化范圍為6.5～128.9 g·kg-1[18]，年均氣溫變化范圍為-2.5 ℃～5.6 ℃，隨著黑土有機(jī)質(zhì)含量和溫度的變化，有機(jī)質(zhì)含量與溫度交互作用對(duì)土壤纖維素酶和β-葡糖苷酶活性的影響尚不明確，并且有機(jī)質(zhì)含量-溫度-施肥之間的交互作用對(duì)纖維素酶和β-葡糖苷酶活性的影響更是鮮有報(bào)道。

空間移位方法作為研究氣候變化對(duì)土壤影響的有效手段，是將土壤移至不同氣候條件下，采用相同的種植、施肥和管理模式來(lái)凸顯氣候?qū)ν寥肋^(guò)程的影響。本研究在典型黑土帶上選取5種有機(jī)質(zhì)含量的農(nóng)田黑土，通過(guò)空間移位的方法分別將其移置在兩種氣候條件下，設(shè)置施肥與不施肥兩種施肥水平，用以研究氣候-有機(jī)質(zhì)-施肥對(duì)農(nóng)田黑土中纖維素酶和β-葡糖苷酶活性的影響，旨在揭示氣候條件和施肥對(duì)不同有機(jī)質(zhì)含量農(nóng)田黑土纖維素酶和β-葡糖苷酶活性的影響，深化對(duì)氣候變化和施肥條件下農(nóng)田黑土中碳循環(huán)過(guò)程的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，由于土壤酶活性是土壤肥力和質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[19-21]，本研究通過(guò)對(duì)土壤酶活性的研究也能深化對(duì)氣候變化和長(zhǎng)期施肥條件下不同有機(jī)質(zhì)含量農(nóng)田黑土肥力和質(zhì)量演變的認(rèn)識(shí)，為應(yīng)對(duì)氣候變化和施肥所帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)黑土區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)域概況

試驗(yàn)地分別設(shè)置在黑龍江省海倫市中國(guó)科學(xué)院海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站(47°27′N(xiāo)，126°56′E)和吉林省德惠市的黑土研究基地(44°12′N(xiāo)，125°33′E)。黑龍江省海倫市屬寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候(MAT1.5)，冬季寒冷干燥，夏季溫?zé)岫嘤辏昶骄鶜鉁?.5 ℃，年降水量500～600 mm，年有效積溫2 400～2 600 ℃，年均日照時(shí)數(shù)為2 600～2 800 h，無(wú)霜期110～125 d。吉林省德惠市屬于中溫帶大陸性季風(fēng)氣候(MAT4.5)，春季多風(fēng)干旱，夏季炎熱多雨，年平均氣溫4.5 ℃，降水量550～600 mm，年有效積溫2 800 ℃左右，年日照時(shí)數(shù)2 600～2 700 h，全年無(wú)霜期135～140 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)始建于2004年秋季。在海倫、德惠兩處試驗(yàn)地分別建立30個(gè)1.4 m×1.2 m×1.0 m(長(zhǎng)×寬×深度)的小區(qū)，小區(qū)之間用20 cm厚的磚墻隔開(kāi)，并在四周覆蓋防水布，底部覆蓋石英砂，以防止小區(qū)之間的水肥互滲。在黑土區(qū)選取5個(gè)有機(jī)質(zhì)含量的農(nóng)田黑土，有機(jī)質(zhì)含量分別為16.6 g·kg-1(SOM1.7)、32.0 g·kg-1(SOM3)、50.6 g·kg-1(SOM5)、58.8 g·kg-1(SOM6)和108.9 g·kg-1(SOM11)，土壤基本理化性狀見(jiàn)表1。按每層20 cm挖掘1 m深土壤剖面，各層次充分混勻后分別運(yùn)送至海倫和德惠兩地，按原容重依次回填至小區(qū)中。試驗(yàn)設(shè)不施肥(CK)與施肥(NPK)兩個(gè)施肥水平，每種有機(jī)質(zhì)含量農(nóng)田黑土中均設(shè)3次重復(fù)。

表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Initial soil properties

試驗(yàn)地于2005年5月起種植玉米，每年種植一季，種植品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N。施肥處理中，肥料種類(lèi)分別為尿素、磷酸二銨和硫酸鉀，施肥量為N 150 kg·hm-2、P2O575 kg·hm-2和K2O 60 kg·hm-2。播種之前，50%氮肥、全部磷肥和鉀肥作為基肥施入，剩余50%氮肥在玉米大喇叭口期追肥。采用人工除草及松地的管理模式[15]。

1.3 土壤樣品采集

土壤樣品采集于2017年玉米收獲后，用φ=2 cm的土鉆在每個(gè)小區(qū)內(nèi)采集0～20 cm土壤，每個(gè)小區(qū)內(nèi)采集10個(gè)點(diǎn)，充分混勻后裝入無(wú)菌聚乙烯袋帶回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)1 mm篩，存于4 ℃冰箱中，用于土壤纖維素酶和β-葡糖苷酶活性的測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

纖維素酶活性的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸比色法[4,22-23]，活性以72 h，1 g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。β-葡糖苷酶活性采用對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷(PNPG)培養(yǎng)-比色法測(cè)定[22]，活性以1 h，1 g土壤對(duì)硝基酚的毫克數(shù)表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

原始數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行整理，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性(α= 0.05)檢驗(yàn)，使用SigmaPlot 12.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣候-有機(jī)質(zhì)-施肥對(duì)農(nóng)田黑土纖維素酶活性的影響

兩種氣候條件下兩種施肥處理中5種有機(jī)質(zhì)含量農(nóng)田黑土中纖維素酶活性變化如圖1所示。MAT4.5條件下，土壤纖維素酶活性在2.56～3.67 mg·kg-1·72 h-1之間，MAT1.5條件下，土壤纖維素酶活性在1.35～3.47 mg·kg-1·72 h-1之間。除SOM1.7外，施肥與不施肥處理中各農(nóng)田黑土土壤纖維素酶活性在MAT4.5條件下顯著高于MAT1.5條件下，并且在不施肥處理中，隨著有機(jī)質(zhì)含量的升高，纖維素酶活性差異減小，但在施肥處理中隨有機(jī)質(zhì)含量升高纖維素酶活性差異逐漸增大。兩種氣候條件下，土壤纖維素酶活性隨土壤有機(jī)質(zhì)含量無(wú)明顯變化規(guī)律。施肥對(duì)不同氣候條件下土壤纖維素酶活性的影響不同，MAT4.5條件下施肥能大幅度提高土壤纖維素酶活性，增加幅度為5.0%～30.1%；但在MAT1.5條件下，施肥卻顯著降低了SOM1.7、SOM6和SOM11中纖維素酶活性，顯著提高了SOM5中纖維素酶活性(P<0.05)，對(duì)SOM3中纖維素酶活性無(wú)顯著影響。

注：不同字母代表處理間在0.05水平上差異達(dá)到顯著。下同。Note: Different letters indicate significant differences between treatments at 0.05 level.The same is as below.圖1 兩種氣侯條件下5個(gè)有機(jī)質(zhì)含量農(nóng)田黑土中土壤纖維素酶活性變化Fig.1 Cellulase activities in Mollisols with five organic matter contents under two climates

2.2 氣候-有機(jī)質(zhì)-施肥對(duì)農(nóng)田黑土β-葡糖苷酶活性的影響

MAT4.5條件下，β-葡糖苷酶活性為82.1～277 mg·kg-1·h-1；MAT1.5條件下，β-葡糖苷酶活性為47.1～259 mg·kg-1·h-1(圖2)。MAT4.5條件下β-葡糖苷酶的活性總體要高于MAT1.5條件下，增高幅度為3.3%～74.0%，但氣候?qū)Ζ?葡糖苷酶活性的影響在不同施肥處理中不同，在不施肥處理中，β-葡糖苷酶活性在MAT4.5條件下一直較高，并且差異隨有機(jī)質(zhì)含量變化不大；但是，在施肥處理中，隨著有機(jī)質(zhì)含量的升高，MAT1.5與MAT4.5條件下β-葡糖苷酶活性差異逐漸減小，并逐漸趨于一致。兩種氣候條件下施肥與不施肥處理中，隨著土壤有機(jī)質(zhì)含量的升高，β-葡糖苷酶的活性均呈升高的趨勢(shì)。在不同氣候條件下，施肥對(duì)土壤中β-葡糖苷酶活性影響不同，MAT1.5條件下施肥能夠提升土壤中β-葡糖苷酶的活性，但在MAT4.5條件下施肥對(duì)β-葡糖苷酶活性的影響不顯著。

2.3 酶活性差異來(lái)源分析

為了進(jìn)一步分析氣候-有機(jī)質(zhì)-施肥及其之間的交互作用對(duì)纖維素酶和β-葡糖苷酶活性的影響，以氣候、有機(jī)質(zhì)含量和施肥作為變量進(jìn)行了方差分析，以檢驗(yàn)3個(gè)因素的主效應(yīng)及交互作用是否造成纖維素酶整體活性和β-葡糖苷酶活性的差異，結(jié)果如表2所示。氣候、有機(jī)質(zhì)含量和施肥的主效應(yīng)是造成纖維素酶整體活性與β-葡糖苷酶活性的主要因素。但是，三者之間兩兩交互作用以及三者間的交互作用對(duì)纖維素酶活性影響均達(dá)到顯著水平，而對(duì)β-葡糖苷酶活性均無(wú)顯著影響。

3 討 論

本研究中，纖維素酶活性隨土壤有機(jī)質(zhì)含量無(wú)明顯變化規(guī)律，這可能是由以下原因造成的：(1)黑土有機(jī)質(zhì)含量高，土壤微生物可利用碳源增加[24]，微生物會(huì)優(yōu)先利用土壤中易分解的碳源，導(dǎo)致對(duì)纖維素的利用下降，酶分泌量減少，進(jìn)而導(dǎo)致酶活性降低；(2)纖維素酶是誘導(dǎo)酶[25]，本研究中進(jìn)入土壤的纖維素底物主要是作物根系，不同有機(jī)質(zhì)含量農(nóng)田黑土中作物根系量可能是造成這種變化趨勢(shì)的原因之一。MAT4.5條件下，施肥能較大幅度的提升纖維素酶活性，可能是由以下原因造成的：(1)纖維素是一類(lèi)C/N很高的有機(jī)化合物，不易被微生物分解，施肥后C/N相對(duì)降低，可促進(jìn)微生物對(duì)其的分解與利用；(2)施肥會(huì)促進(jìn)土壤中微生物的生長(zhǎng)[26-27]，碳源競(jìng)爭(zhēng)作用增強(qiáng)，部分微生物可將纖維素作為一種碳源，進(jìn)而分泌更多的纖維素酶，使得土壤中纖維素酶活性增強(qiáng)；(3)施肥促進(jìn)作物根系生長(zhǎng)，進(jìn)入土壤中的纖維素類(lèi)底物增多，進(jìn)而誘導(dǎo)更多的纖維素酶產(chǎn)生，使其活性增強(qiáng)。MAT1.5條件下的纖維素酶活性低于MAT4.5條件下的，這主要是由酶的熱力學(xué)性質(zhì)所決定的，即在一定范圍內(nèi)土壤酶活性隨溫度升高而增強(qiáng)[4,28]；但MAT1.5條件下施肥對(duì)纖維素酶的促進(jìn)作用不顯著，這可能是由于溫度在很大程度上限制了纖維素酶的活性，也有可能是纖維素分解酶系中某種酶的活性受到了溫度的限制。

圖2 兩種氣候條件下5個(gè)有機(jī)質(zhì)含量農(nóng)田黑土中土壤β-葡糖苷酶活性變化Fig.2 β-glucosidase activities in Mollisols with five organic matter contents under two climates

纖維素酶 Cellulaseβ-葡糖苷酶 β-glucosidaseFSig.FSig.氣候 Climate435.598<0.00116.0700.001施肥 Fertilization93.265<0.0018.2550.009土壤有機(jī)質(zhì) Soil organic matter51.475<0.001100.129<0.001氣候×施肥 Climate×Fertilization71.115<0.0014.2810.051氣候×土壤有機(jī)質(zhì) Climate×Soil organic matter62.904<0.0011.8300.161施肥×土壤有機(jī)質(zhì) Fertilization×Soil organic matter54.550<0.0011.5060.237氣候×施肥×土壤有機(jī)質(zhì) Climate×Fertilization×Soil organic matter48.090<0.0012.4690.076

β-葡糖苷酶是纖維素水解過(guò)程中催化纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的酶，直接催化纖維素分解的最后一步過(guò)程，其活性直接限制纖維素的水解[2]。β-葡糖苷酶可由多種真菌產(chǎn)生，包括土壤中的子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)[29]。本研究中，隨土壤有機(jī)質(zhì)含量的增加，β-葡糖苷酶的活性也隨之增加，這說(shuō)明在本研究選取的5種農(nóng)田黑土中，纖維素分解酶系中的其他酶可能是限制纖維素酶活性的主要因素，而不是最后一步反應(yīng)中的β-葡糖苷酶。MAT4.5條件下β-葡糖苷酶的活性要高于氣候較冷條件下的，這與Looby和Treseder[11]的研究結(jié)果一致，這可能是由酶本身的熱力學(xué)性質(zhì)所決定的。但是，施肥會(huì)使兩種氣候條件下不同有機(jī)質(zhì)含量農(nóng)田黑土中β-葡糖苷酶的活性大小趨于一致，說(shuō)明施肥能夠削弱溫度對(duì)β-葡糖苷酶活性的影響。

綜上所述，氣候、土壤有機(jī)質(zhì)含量和施肥均會(huì)對(duì)土壤纖維素酶和β-葡糖苷酶活性產(chǎn)生影響。但是，作為纖維素分解過(guò)程中的限制酶，β-葡糖苷酶活性與纖維素酶整體活性變化規(guī)律并不一致。這種現(xiàn)象可能是由于測(cè)定過(guò)程中底物濃度差異所造成的，在一定范圍內(nèi)，酶的催化速率與底物濃度呈正相關(guān)關(guān)系[28]。纖維素酶是一個(gè)酶系而不是一種單一酶，主要由β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶組成，并且β-葡糖苷酶能催化的底物只有β-葡聚糖酶和內(nèi)切β-葡聚糖酶催化分解的產(chǎn)物[25]。在纖維素酶活性測(cè)定過(guò)程中，可能β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶活性較低，導(dǎo)致β-葡糖苷酶底物不足，最終呈現(xiàn)出纖維素酶整體活性較低；但在β-葡糖苷酶活性測(cè)定過(guò)程中，直接供給充足的分解底物，β-葡糖苷酶活性不受底物濃度所限制，能夠較真實(shí)的展現(xiàn)其活性。為了更好地認(rèn)識(shí)氣候-有機(jī)質(zhì)-施肥對(duì)土壤纖維素酶活性的影響，將來(lái)還需要進(jìn)一步分析土壤微生物群落組成，明確土壤纖維素酶的來(lái)源，揭示土壤中纖維素分解的微生物學(xué)機(jī)制。

4 結(jié) 論

(1)在農(nóng)田黑土中，隨著土壤有機(jī)質(zhì)含量增強(qiáng)，土壤纖維素酶活性無(wú)明顯變化規(guī)律，但β-葡糖苷酶活性卻呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。

(2)年均溫升高，土壤纖維素酶活性顯著升高，但β-葡糖苷酶的活性升高幅度不大。

(3)MAT4.5條件下，施肥能較大幅度提升土壤纖維素酶活性和β-葡糖苷酶活性，但在MAT1.5條件下，施肥對(duì)土壤酶活性的影響較小。

(4)氣候、土壤有機(jī)質(zhì)含量和施肥均是導(dǎo)致農(nóng)田黑土纖維素酶與β-葡糖苷酶活性差異的重要因素，但各因素的交互作用只對(duì)土壤纖維素酶活性有顯著影響。