體外生物測定法在食品接觸材料安全性評價中的應用研究進展

王文娟，蔡小芳，唐 潔，張喜榮，封 棣*

（北京工商大學食品學院，北京市食品添加劑工程技術研究中心，食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048）

食品接觸材料（food contact materials，F(xiàn)CM）中的有意添加物（intentionally added substance，IAS）（如單體添加劑、聚合物生產(chǎn)助劑等）以及非有意添加物（non intentionally added substance，NIAS）（如反應產(chǎn)物、分解產(chǎn)物等）可能會在與食品接觸過程中遷移至食品，從而對人體健康造成潛在風險[1]。化學分析測試是FCM化學遷移安全性評價中的重要組成部分，主要有2 種方式：一種是常規(guī)的符合性測試，是對IAS遷移物進行有目標地分析，產(chǎn)品除了要求使用成分必須列于歐盟相關法規(guī)的肯定清單中，還必須證明產(chǎn)品符合總遷移、特定遷移以及殘留限量的要求；另一種是對NIAS的無預期目標物的測試[2]。一直以來，對NIAS的識別和量化非常困難，且耗時長，是FCM化學遷移的安全評價所面臨的一大挑戰(zhàn)。近年來，隨著高靈敏、高分辨質(zhì)譜與高效分離色譜聯(lián)用技術的發(fā)展，以及高效多樣的樣品前處理技術的應用，使得FCM中的化學遷移物（揮發(fā)性、中等揮發(fā)性以及難揮發(fā)性物質(zhì)）可以得到較全面地分析[3-9]。Bengtstr?m等[3]利用氣相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜和超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜對顯示出芳香烴受體活性的回收比薩盒的提取液進行了全面地非靶標物質(zhì)初步鑒定；本實驗室使用吹掃捕集[4-5]、固相微萃取[4,6-7]、超聲萃取技術[7]等前處理技術與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對食品接觸硅橡膠制品中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)進行了分析。但是由于FCM組成復雜，其對遷移物的分析不可能是完整詳盡的，也無法評價FCM化學遷移的整體安全性。

體外生物測定法是利用酵母、細菌或細胞等進行的生物體外短期毒性實驗，可有效針對生物體某一特異性效應，評價測試物的危害性以及探索其毒性作用機制，符合動物福利指導準則3R原則（減少（reduce）、優(yōu)化（refine）和代替（replace）），是動物實驗的傳統(tǒng)替代技術[10-11]，具有成本低、時間短等優(yōu)點。歐洲議會發(fā)表在2016年10月的2015/2259/（INI）[12]報告提出：應鼓勵將生物測試作為一種可選的預警措施，以確?；瘜W成分復雜FCM的安全性，并用于開發(fā)FCM化學分析和毒理測試的研究。體外生物測定法可以檢測出不能通過化學分析或定量結(jié)構-活性關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）預測的FCM的潛在毒性，能夠提供FCM化學遷移（混合物）的實際危險和質(zhì)量評估的綜合信息[13]。目前，對FCM的體外生物測定主要集中在細胞毒性[14-15]、遺傳毒性[16-17]和內(nèi)分泌干擾[18-20]這3 類毒性終點，近年來已被應用于塑料[14]、紙質(zhì)[21-23]、罐頭涂層[24]、納米材料[16]等FCM中化學遷移物的毒性評價。

1 細胞毒性

細胞毒性物質(zhì)通過干擾細胞穩(wěn)態(tài)，破壞細胞完整性或細胞基礎功能，導致細胞壞死或凋亡[13]。細胞毒性實驗采用體外方法，以生物學性狀基本相同的細胞系（或株）為對象，避免了活體動物的使用及其個體差異，操作簡單；檢測終點靈敏度高，可以在細胞存活狀態(tài)下，觀察細胞毒性物質(zhì)對細胞內(nèi)結(jié)構和功能的影響，分析作用機理和劑量-效應關系。依據(jù)不同的檢測終點，細胞毒性檢測有多種方法。

1.1 細胞通透性的改變

細胞通透性的改變是常見的細胞毒性終點之一[13]。它的原理是將細胞暴露于待測物中，向其中加入實驗所用染料并進行培養(yǎng)，根據(jù)染料對細胞的作用或者染料進入細胞的情況，檢測細胞活力或者間接判斷細胞膜通透性的改變情況，獲得關于細胞通透性損傷的信息。最常用的檢測方法是中性紅攝入（neutral red uptake，NRU）實驗。NRU實驗是基于細胞對中性紅的攝入能力來檢測細胞增殖或細胞毒性的方法?；罴毎梢詳z入中性紅，并在溶酶體中積累；當細胞增殖加快，數(shù)量增多時，中性紅攝入量增加；當細胞受到損傷時，中性紅攝入量下降，通過檢測中性紅攝入量可以確定其對細胞的影響情況。

1.2 細胞增殖的破壞

細胞增殖的破壞也是常見的細胞毒性終點之一，它的原理是毒性物質(zhì)發(fā)揮作用殺死細胞或阻斷細胞周期，從而減少整個群體的增殖。檢測方法除了生化方法，如細胞中總蛋白質(zhì)含量（total protein content，TPC）測定實驗和5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）摻入實驗[25]之外，還有細胞計數(shù)法和噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）或衍生物（MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium salt）、WST-1（4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate tetrazolium salt））實驗。MTT實驗是利用顯色劑MTT檢測細胞存活和生長的方法。MTT能被活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶還原，成為不溶性的藍紫色結(jié)晶物甲臜，并沉積在細胞內(nèi)；而死細胞則沒有這種功能。

1.3 RNA合成的抑制

RNA合成抑制實驗是將氚標記的尿苷加入處理后的細胞RNA中，測量RNA合成動力學，如果與陰性對照相比RNA合成的動力降低30%或更多，則認為待測物具有細胞毒性。RNA合成抑制實驗可靠、靈敏、重現(xiàn)性好。Riquet等[14]采用RNA合成抑制實驗研究分別由抗氧化劑Irgafos 168、抗氧化劑Irganox 1076和紫外線吸收劑Tinuvin 326制備的聚丙烯（polypropylene，PP）薄膜的細胞毒性，結(jié)果表明，在薄膜的模擬使用環(huán)境（微波和電子束）下，只有Irgafos 168制備的PP薄膜提取物在RNA合成抑制實驗中顯示出強細胞毒性。

1.4 測試方法的聯(lián)用

近20 年來用于評估FCM提取物細胞毒性的測定方法、原理及應用總結(jié)如表1所示。

表1 近20 年來FCM提取物的細胞毒性生物測定方法Table 1 Cytotoxic bioassays for FCM extracts published in the literature in the last 20 years

由于每種測試方法指示的毒性途徑不同，研究人員將幾種測試方法聯(lián)用從而獲得更多的毒性信息。Maisanaba等[15]采用NRU、MTS實驗對2 種用于FCM的硅烷改性黏土礦物進行體外細胞毒性評價，結(jié)果顯示，在選擇的質(zhì)量濃度范圍（0～250 μg/mL）內(nèi)，一種樣品在NRU和MTS實驗中均無細胞毒性；而另一種樣品在2 種實驗中均表現(xiàn)出顯著的細胞毒性。Mittag等[24]采用4 種測定方法（BrdU-酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、WST-1、NRU、RNA合成抑制實驗）以及4 種細胞系（人宮頸癌細胞Hela-S3、人結(jié)腸癌細胞Caco-2、人結(jié)腸癌細胞HT-29、人肝癌細胞HepG2），評估2 種罐涂料（聚酯樹脂和環(huán)氧樹脂）95%乙醇遷移液的細胞毒性，最終不同方法顯示的細胞毒性結(jié)果也不同。相同的是，2 種罐涂料均對Caco-2細胞顯示出細胞毒性作用，但僅有環(huán)氧樹脂涂料對HepG2細胞顯示出顯著的細胞毒性。Maisanaba等[16]采用MTS、NRU、TPC方法分別研究了含有2 種改性黏土的聚乳酸（polylactic acid，PLA）納米復合材料的提取物對Caco-2和HepG2細胞系的細胞毒性。在不同的細胞和暴露時間（24、48 h）條件下，3 種測試方法的結(jié)果均為陰性。Bradley等[21]用NRU、TPC和RNA合成抑制實驗，在人喉癌上皮細胞系Hep-2、小鼠肝癌細胞系Hepa1c1c7、HepG2和HeLa細胞系中研究了19 份食品接觸紙或紙板的熱水、冷水、95%乙醇和Tenax提取物的細胞毒性。結(jié)果顯示水或Tenax提取物呈陰性，4 份樣品的95%乙醇提取液呈陽性。Maisanaba等[26]使用Caco-2細胞系對暴露24 h和48 h后的2 種硅烷改性黏土進行NRU和MTS實驗，結(jié)果顯示暴露24 h和48 h后2 種樣本均呈陰性。

2 遺傳毒性

遺傳毒性是指DNA在染色體水平、分子水平和堿基水平上受到各種損傷，從而造成基因突變、染色體結(jié)構和數(shù)量改變的毒性作用，可能引起癌癥、遺傳疾病和先天性缺陷。

2.1 致突變

致突變最常用的是鼠傷寒沙門氏菌/組氨酸回復突變實驗（Ames實驗）。Ames實驗需要在4 種標準實驗菌株（鼠傷寒沙門菌TA98、TA97、TA100、TA102）上進行，并分別進行不加及加代謝活化系統(tǒng)（S9混合物）的檢測，是應用最廣泛的檢測基因突變的體外實驗。其原理是檢測待測物誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌/組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株（his－）回復突變成野生型（his+）的能力。根據(jù)選擇性培養(yǎng)基上生長的細菌菌落數(shù)目，與對照組自發(fā)回復突變菌落數(shù)目相比較，來測定化學物質(zhì)誘導微生物基因突變的能力。該方法具有靈敏度高、檢出率高、操作簡便等優(yōu)點。Ames II實驗作為Ames實驗的一種有效替代方法，使用2 種菌株（TA98和混合菌株TA7001-7006）即可進行檢驗，其對誘變劑敏感性更強，實驗結(jié)果可重復性更好，實驗室間差異小[27]。

Maisanaba等[16]用Ames實驗評估了2 種PLA納米復合材料提取物的致突變性，結(jié)果為陰性。Mittag等[24]使用Ames II實驗檢測了2 種罐涂料（聚酯纖維和環(huán)氧樹脂）的95%乙醇提取液，結(jié)果均為陰性，但是該研究沒有添加外源代謝系統(tǒng)（S9混合物），因此可能產(chǎn)生假陰性數(shù)據(jù)。徐峰等[28]對二氧化碳基塑料進行了Ames實驗，結(jié)果為陰性，表明該材料沒有致突變性。

2.2 DNA原始損傷

2.2.1 彗星實驗（Comet實驗）

Comet實驗是檢測單個細胞DNA損傷和修復的實驗。它可以檢測到DNA單、雙鏈斷裂，堿基活性損傷以及DNA修復期間產(chǎn)生的DNA鏈斷裂。在Comet實驗中，細胞DNA受到損傷產(chǎn)生鏈斷裂，其碎片進入凝膠中，在凝膠電泳時碎片離開核DNA形成尾狀帶，未損傷的DNA部分保持球形。Comet實驗具有快速、簡單、靈敏的特點，少量細胞就可以分析，無需放射性標記，適用于任何可制成單細胞懸液的真核細胞，而且適用范圍廣、敏感性高。

Ozaki等[22]利用人早幼粒急性白血病細胞系HL-60進行了Comet實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8 份紙板樣品中有6 份呈顯著陽性。蔡亞云等[29]用Comet實驗研究了不同粒徑（10 nm～1 μm）的聚苯乙烯（polystyrene，PS）塑料顆粒對斑馬魚腮細胞的毒性影響，結(jié)果呈陽性。Riquet等[14]使用Comet實驗研究分別由抗氧化劑Irgafos 168、Irganox 1076和紫外線吸收劑Tinuvin 326制備的PP薄膜的遺傳毒性，12 種提取物的測試結(jié)果全部為陰性。Maisanaba等[26]使用Caco-2細胞系對暴露24 h和48 h后的2 種硅烷改性黏土進行Comet實驗以評估其遺傳毒性，結(jié)果均呈陰性。

2.2.2 BlueScreen HC測定法

BlueScreen HC測定法是基于人體細胞報告基因的一種檢測方法，專為高通量篩選化學物質(zhì)遺傳毒性而設計。其原理是利用Gaussia熒光素酶，檢測經(jīng)基因修飾的包含GADD-45a啟動子的人類淋巴母細胞TK6。目前已經(jīng)在藥物制劑和香精香料等領域驗證了該方法的可行性[30]。Koster等[31]利用該法（加或不加S9混合物）檢測了3 種紙板提取物的遺傳毒性，結(jié)果為陰性。

2.3 染色體和染色體組畸變

2.3.1 微核實驗

微核（micronuclei，MN）實驗可以檢測位于人類或嚙齒動物細胞系間期細胞細胞質(zhì)中的MN，從而有效檢測致癌物和致敏物?？捎糜贛N實驗的哺乳類動物細胞有骨髓細胞、肝細胞、淋巴細胞等。

2.3.2 姐妹染色單體交換實驗

姐妹染色單體交換（sister chromatid exchange，SCE）實驗是用于檢測雙染色體姐妹染色單體之間DNA相互交換的生物測定法。SCE實驗的檢測核心是差異地標記姊妹染色單體，即利用BrdU摻入DNA分子中觀察姐妹染色單體，觀察不同數(shù)量胸腺嘧啶核苷組成的染色體區(qū)域[32]。Ergene等[33]在人類血液淋巴細胞上進行SCE實驗來評估多種聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）瓶裝飲用水的遺傳毒性，結(jié)果均為陰性。

2.3.3 染色體畸變實驗

染色體畸變（chromosome aberration，CA）實驗是檢測化學物質(zhì)影響染色體數(shù)量和結(jié)構的基本方法，其原理是將哺乳動物細胞暴露于待測物中，在暴露后的預定時間間隔內(nèi)，用中期停滯物質(zhì)（秋水仙堿）處理細胞，收集細胞并染色，用顯微鏡分析以檢查CA情況。

2.4 測試方法的聯(lián)用

由于每種測試方法指示的毒性途徑不同，研究人員將幾種測試方法聯(lián)用從而獲得更多的遺傳毒性信息。Nakai等[34]利用Ames實驗和CA實驗（中國倉鼠肺細胞CHL/IU）評估了與食品接觸PS材料中丙酮提取物的遺傳毒性，測試結(jié)果均為陰性。Bach等[17]采用Ames實驗和MN實驗（HepG2細胞）測試暴露在陽光或高溫條件下PET瓶裝飲用水提取物的遺傳毒性，結(jié)果均為陰性。Maisanaba等[15]采用Ames和Comet實驗對2 種用于FCM的硅烷改性黏土礦物進行評價，一種樣品在2 種實驗中均為陰性，另一種樣品則在2 種實驗中均表現(xiàn)出顯著的DNA氧化損傷。Bradley等[21]用Ames實驗和Comet實驗對用不同提取物（熱水、冷水、95%乙醇、Tenax）提取的19 份食品接觸紙或紙板以及1 份非食品接觸紙板進行研究。Ames實驗結(jié)果表明，20 份樣品的乙醇提取物中有1 份呈陽性，Comet實驗中水或Tenax提取物呈陰性。Lionti等[35]用Ames實驗和MN實驗研究3 種用于合成食品接觸涂料常見前體的遺傳毒性，包括原硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS）、甲基三乙氧基硅烷（methyltriethoxysilane，MTES）和3-縮水甘油氧基丙基三乙氧基硅烷（3-glycidyloxypropyltriethoxysilane，GPTES）。Ames實驗結(jié)果顯示，加或不加S9混合物的情況下，TEOS和MTES均無致突變性，GPTES在TA100和TA1535菌株中觀察到陽性反應；MN實驗中，3 種樣本全部呈陰性。Séverin等[36]采用Ames實驗和MN實驗評估聚碳酸酯上2 種溶膠-凝膠涂料的體外遺傳毒性，結(jié)果均為陰性。Souton等[37]通過Comet實驗和MN實驗研究回收紙板起始和最終產(chǎn)品的遷移物在人肝癌細胞（HepG2/HepaRG）上誘導的遺傳毒性，結(jié)果呈陽性，此外，F(xiàn)CM起始物表現(xiàn)出的DNA損傷可能會得到進一步的修復，而最終產(chǎn)品可能會將DNA損傷轉(zhuǎn)化為染色體突變，從而證實了評價最終產(chǎn)品提取物危害的重要性。

近20 年來用于評估FCM提取物遺傳毒性的生物測定方法、原理總結(jié)見表2。

表2 近20 年來FCM提取物遺傳毒性的生物測定方法Table 2 Genetic toxicity bioassays for FCM extracts published in the literature in the past 20 years

3 內(nèi)分泌干擾效應

內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs）主要包括性激素（雌/雄/孕激素）干擾物、腎上腺皮質(zhì)激素（糖/鹽皮質(zhì)激素）干擾物等，可通過干擾人體內(nèi)天然激素的活動過程從而對生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等功能產(chǎn)生影響。EDCs可以與人體和動物體內(nèi)特定的激素受體結(jié)合，從而干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能。研究發(fā)現(xiàn)從食品包裝遷移到食品中的化學物質(zhì)（如雙酚A（bisphenol A，BPA）、鄰苯二甲酸鹽）會導致EDCs對人體的入口暴露[38-39]，因此內(nèi)分泌干擾逐漸成為國內(nèi)外研究人員高度關注的問題，也是評估FCM安全性的一個重要毒性終點。FCM內(nèi)分泌干擾效應的測試方法主要有人乳腺癌MCF-7細胞增殖實驗（E-Screen實驗）和報告基因測試法。

3.1 E-Screen實驗

E-Screen實驗的原理是雌激素活性物質(zhì)可以與雌激素受體（estrogen receptor，ERs）結(jié)合并刺激ER+細胞增殖，因其簡單易行而被廣泛應用于雌激素活性物質(zhì)的篩選。實驗比較在不存在雌激素（陰性對照）、存在17β-雌二醇（陽性對照）、存在待測物的情況下，接種MCF-7細胞所獲得的細胞數(shù)量。Wagner等[18]利用E-Screen實驗分析18 種包裝在玻璃瓶或PET瓶中的礦泉水，結(jié)果18 份樣品中的11 份樣品檢測到雌激素活性。武宗高等[40]利用該法檢測3 種增塑劑鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、BPA和壬基酚（nonyl phenol，NP）的雌激素活性及其聯(lián)合效應，結(jié)果表明DBP、BPA和NP均能夠促使細胞進入S期（DNA合成期），顯著促進MCF-7細胞增殖，具有雌激素活性。Lopez-Espinosa等[23]檢測40 種紙或紙板乙醇提取物的雌激素活性，結(jié)果90%樣品的提取物呈陽性。

3.2 報告基因測試

3.2.1 酵母菌雌（雄）激素篩選實驗

在酵母菌雌（雄）激素篩選（yeast estrogen screen，YES）/（yeast androgen screen，YAS）測定中，酵母菌株含有穩(wěn)定整合的人類雌（雄）激素受體（hERα/hAR）基因和受雌（雄）激素反應元件（ERE/ARE）控制的含有l(wèi)acZ報告基因（編碼β-半乳糖苷酶）的表達質(zhì)粒。酵母中的雌（雄）激素受體基因被雌（雄）激素活性物質(zhì)激活，在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和合成過程中，報告基因也同時被激活，編碼β-半乳糖苷酶的基因表達并轉(zhuǎn)錄生成β-半乳糖苷酶，通過測定其活性來定量出待測物的類雌（雄）激素活性。它可以檢測雌（雄）激素活性（YES/YAS）及抗雌（雄）激素（YAES/YAAS）活性。該實驗的優(yōu)點是原理簡單、易于操作、費用低廉，且酵母不具有內(nèi)源性受體，不存在核受體干擾現(xiàn)象。

G u a r t等[19]使用YA E S/YA A S分析方法研究Tritan? BPA替代樹脂和聚碳酸酯的遷移。在40 ℃水中放置10 d后，檢測結(jié)果為陰性。Wagner等[41]使用YES檢測法分析20 種包裝在玻璃瓶或PET瓶中的礦泉水，結(jié)果60%的樣品檢測出雌激素活性。此后，Wagner等[42]又用YAES和YAAS分析18 種瓶裝水的抗雌激素活性和抗雄激素活性，結(jié)果表明，13 種樣品有抗雌激素活性，16 種樣品有抗雄激素活性。Kirchnawy等[43]對不同食品包裝用塑料的提取物進行研究，首先使用YES實驗分析了PET、PP、聚乙烯（polyethylene，PE）、PS和復合薄膜提取物的雌激素效應，結(jié)果顯示42 個樣品中有7 個樣品出現(xiàn)雌激素受體陽性，11 種PET樣品的雌激素活性均為陰性；然后使用YES、YAS并結(jié)合化學分析（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）對樣品中的雌激素和雄激素活性物質(zhì)進行了表征，結(jié)果表明，18 個樣品中的4 個樣品在YES測定中顯示雌激素活性。Mertl等[44]研究3 種食物接觸紙板的提取物，其中2 種在YAAS中顯示出抗雄性激素活性。

3.2.2 熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

熒光素酶是生物體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱，可分為螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶。熒光素酶報告基因?qū)嶒炇且詿晒馑貫榈孜?，靠酶和底物的相互反應發(fā)光，通過熒光測定儀也稱化學發(fā)光儀或液閃測定儀檢測螢火蟲熒光素酶活性的實驗。這一實驗具有特異性強、靈敏度高、信噪比高等優(yōu)點。

Bach等[17,45]使用HepG2細胞系和人乳腺癌細胞株MDA-MB453-kb2研究了暴露于陽光（2、6、10 d）和高溫（40、50、60 ℃）下PET瓶裝水及玻璃瓶裝水的雌激素活性和抗雄激素活性，結(jié)果均為陰性。Plotan等[20]利用報告基因檢測結(jié)合固相萃取技術，研究了14 個品牌（共42 份樣品）瓶裝礦泉水的內(nèi)分泌干擾能力，結(jié)果在78%的樣本中發(fā)現(xiàn)雌激素受體（ER）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）活性。Maggioni等[46]使用Hela細胞分析了在意大利市場購買的5 種PET瓶裝礦泉水的雌激素受體活性，結(jié)果為陰性。Chevolleau等[47]使用Hela細胞系研究7 種PET瓶裝水和4 種玻璃瓶裝水的多種激素活性（ER、AR、PR、GR、甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor，TR）），結(jié)果為陰性。Séverin等[36]使用HepG2細胞系通過轉(zhuǎn)錄激活檢測評估聚碳酸酯上2 種溶膠-凝膠涂料的雌激素活性，結(jié)果為陰性。Veyrand等[48]使用人骨肉瘤細胞系U2OS對PS/PE塑料杯中抗氧化劑亞磷酸三壬基酚酯（tris(nonylphenyl) phosphite，TNPP）的降解產(chǎn)物4-壬基酚（4-nonyl phenol，4-NP）進行雌激素活性和抗雄激素活性，結(jié)果均為陽性。Rosenmai等[49]在人卵巢腺癌細胞系BG1Luc4E2、中國倉鼠卵巢細胞系ATCC、小鼠胚胎成纖維細胞系NIH-3T3、大鼠肝癌細胞H4IIE和U2OS細胞系中，對20 個食品接觸類紙和紙板進行8 種報告基因（AR、ER、芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）、過氧化酶增殖激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、GR、視黃酸受體（retinoic acid receptor，RAR）、核轉(zhuǎn)錄因子2（nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2，Nrf2）和腫瘤抑制基因53（transformation-related protein 53，p53））測定，結(jié)果顯示，20 種樣本中11 種具有AR活性和抗AhR活性，9 種具有ER活性，12 種具有PPARγ活性，16 種具有Nrf2活性，6 種具有p53活性，但是20 種樣本對RAR和GR受體均為陰性。

3.3 測試方法的聯(lián)用

表3 FCM內(nèi)分泌干擾性的生物測定Table 3 ndocrine disruption bioassays for FCM extracts

表3 FCM內(nèi)分泌干擾性的生物測定Table 3 ndocrine disruption bioassays for FCM extracts

檢測方法 FCM 提取物 菌株/細胞 結(jié)果 參考文獻PET/玻璃 水 MCF-7細胞陽性（23/29樣本雌激素活性）陽性（11/29樣本抗雌激素活性）陽性（8/29樣本雄激素活性）陽性（12/29樣本抗雄激素活性）[50]E-Screen PET/玻璃 水 MCF-7細胞 陽性（11/18樣本雌激素活性） [18]BPA替代樹脂（PS/TritanTM） 乙醇 MCF-7細胞 不同（不同聚合物、包裝和過程） [51]DBP/BPA/NP DMSO MCF-7細胞 陽性（雌激素活性） [40]紙/紙板 乙醇 MCF-7細胞 陽性（36/40樣本雌激素活性） [23]PET/PP/PE/PS/復合薄膜/紙板 DMSO 重組酵母菌株陽性（4/18樣本雌激素活性）陰性（雄激素活性)陽性（大多數(shù)樣本拮抗活性）[43]報告基因檢測酵母YAES/YAAS奶制品紙盒 DMSO 重組酵母菌株 陽性（2/3樣本抗雄激素活性） [44]PET/PP/PE/PS/復合薄膜 乙醇 重組酵母菌株 陽性（7/42樣本雌激素活性） [43]Tritan TM/聚碳酸酯 水 重組酵母菌株 陰性（2/2樣本（抗）雌激素和（抗）雄激素活性） [19]PET/玻璃（YES） 水 重組酵母菌株 陽性（12/20樣本雌激素活性） [41]PET（YAES/YAAS） 水 重組酵母菌株 陽性（13/18樣本抗雌激素活性）陽性（16/18樣本抗雄激素活性） [42]PET/玻璃 水 PALM細胞 陽性（8/29樣本雄激素活性）陽性（12/29樣本抗雄激素活性） [50]（PS/TritanTM） 乙醇 大鼠肝癌細胞（H4IIE） 陽性（雌激素活性） [51]BPA替代樹脂PET 水 MDA-kb2/HepG2細胞 陰性（抗雄激素和雌激素活性） [17, 45]PET 水 MCF-7/T47D細胞[20]熒光素酶報告基因?qū)嶒炾栃裕?6/42樣本雌激素活性）陽性（16/42樣本雄激素活性）陽性（12/42樣本抗雄激素活性）陽性（15/42樣本孕激素活性）陽性（23/42樣本糖皮質(zhì)激素活性）PET 水 HeLa細胞 陰性（5/5樣本雌激素活性） [46]PET/玻璃 水 HeLa細胞 陰性(11/11樣本類雌（雄）激素活性） [47]PS/PE DMSO U2OS細胞 陽性 [48]食品接觸紙/紙板 DMSO ATCC細胞（AR）H4IIE細胞（AhR）BG1Luc4E2細胞（ER）NIH-3T3細胞（PPARγ）U2OS細胞（GR/RAR/Nrf2/p53）11/20樣本AR陽性；11/20樣本抗AhR陽性；9/20樣本ER陽性；12/20樣本PPARγ陽性；16/20樣本Nrf2陽性；6/20樣本p53陽性）20/20樣本RAR和GR陰性[49]溶膠-凝膠涂料 乙醇 HepG2細胞 陰性（2/2樣本雌激素活性） [36]

Real等[50]應用E-Screen實驗和人前列腺癌細胞PALM的螢光素酶測定法調(diào)查了西班牙南部市售的29 種飲用水（PET及玻璃瓶包裝）的激素活性（雌激素、雄激素激動劑和拮抗劑作用）。E-Screen實驗證明了所有樣品中都含有至少一種激素活性；PALM細胞螢光素酶實驗中，29 個樣品中8 個顯示雄激素受體活性，12 個樣品為抗雄激素受體活性。Bittner等[51]采用E-Screen實驗和報告基因測試對14 種熱塑性樹脂的提取物（10%、50%、100%乙醇和鹽水）進行研究，結(jié)果表明，3 種TritanTM樹脂在鹽水提取后表現(xiàn)出顯著的ER活性。近年來用于評估FCM內(nèi)分泌干擾性的生物測定方法、原理及應用總結(jié)見表3。

4 結(jié) 語

體外生物測定法可以針對特定的毒理學終點進行研究，具有敏感、快速等優(yōu)點。目前針對FCM危害的體外生物測定的研究主要集中在FCM提取物的細胞毒性、遺傳毒性和內(nèi)分泌干擾性方面。體外生物測定法可以檢測出不能通過化學分析或QSAR預測的潛在毒性（特別是NIAS），由于包含了“雞尾酒效應”（由于累加效果甚至協(xié)同效應，使得混合化學品的毒性超過各自單獨效應的總和），它能夠提供FCM提取物的實際危險和質(zhì)量評估的綜合信息，還可與化學分析結(jié)合，共同應用于FCM的風險評估。

目前國內(nèi)有關FCM安全性評價的體外生物測定的相關研究極少。鑒于體外生物分析方法的獨特優(yōu)點與快速篩選能力，建議深入研究并推廣其在FCM安全性評價中的應用，并探索評價方法的標準化，積極推進通用、快速、有效的FCM安全性評估生物測定方法體系的建立。