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      淺析芒果屬植物葉綠體DNA提取方法

      2019-09-01 12:54何飛宇
      農村經(jīng)濟與科技 2019年5期
      關鍵詞:提取方法

      何飛宇

      [摘要]芒果是重要的經(jīng)濟果樹之一,富含多糖、單寧、多酚等次生代謝的干擾物質,不易獲取DNA?;诖?,為提升提取DNA的質量,以芒果屬植物為研究對象,通過對比芒果與扁桃成熟葉片中的DNA質量情況,分析芒果屬植物葉綠體的DNA提取方法。

      [關鍵詞]芒果屬;植物葉綠體;DNA;提取方法

      [中圖分類號]S667.7[文獻標識碼]B

      我國多個芒果屬中芒果的經(jīng)濟效益最高,栽培范圍最廣。我國是栽培芒果的重要國家,并且芒果資源較為豐富,種類已達到1000多種。已有學者采用植物學、生物化學、分子生物學等方式鑒定芒果屬的果類種質與親緣關系,但從總體來看采用植物葉綠體提取芒果屬的DNA較為方便。

      1 實驗試劑與過程

      實驗地點為廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所。實驗的材料為芒果、扁桃。實驗藥品有Buffer I:50 mmol·L-1 Tris C(pH值為8.0),30 mmol·L-1 EDTA,1.2 mol·L-1 NaCl,0.2 mol·L-1 Vc(抗壞血酸),10 g·L-1 PVP即聚乙烯毗咯琳酮C(pH值為3.6)。Buffer II:50 mmol·L-1 Tris(pH值為8.0),30 mol·L-1 EDTA,1.2 mol·L-1 NaCl,5 mmol·L-1 p-琉基乙醇,p=0.1%(W/V)BSA(牛血蛋清白)。Buffer III:120 mmol·L-1 NaCl,80 mmol·L-1 EDTA,10 g·L-1 PVP C(pH值為8.0)。Buffer IV:50 mmol·L-1 Tris(pH值為8.0),30 mmol·L-1 EDTA。TE:0.4 mol·L-1 NaCl,10 mmol·L-1 Tris-HCl,1.0 mmol·L-1 EDTA。

      采用綠色、健康、無病蟲害的葉片數(shù)張,采集后將其放置在預冷的水壺中,然后將其快速帶入實驗室,然后再用干凈的紗布擦拭干凈,應保證葉片干凈后才能開展相關的實驗工作。同時,再用錫箔紙來包裹葉片做好遮光工作,將其放置在4 ℃的環(huán)境內48 h,之后再經(jīng)過液痰后快速進行冷凍處理,然后將其放置在-70 ℃的保存箱內進行備用。

      2 實驗具體方法

      2.1芒果DNA檢測

      提取芒果的基因組質量,與提取材料和材料保存有關。磚紅色的幼嫩芒果葉片材料,含有豐富且高濃度的DNA基因組;由于保存時間或是老化現(xiàn)象,提取DNA基因組時芒果葉片中的單寧、多糖、多酚等一些次生代謝的物質含量較高。提取芒果DNA基因組時,應將材料保存好,并做好前期的材料準備工作,此外也應注重提取芒果基因組DNA的操作技術,確保芒果屬DNA基因組的提取質量,例如采用液氮方法研磨材料。

      2.2實驗方法cPDNA的電泳檢測和OD值的測定

      實驗時取出2 μL的cpDNA溶液,然后在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳,并將電泳的緩沖設置為0.5×TBE、電泳設置為45 min、恒壓設置為110 V,并在紫外凝膠成像系統(tǒng)內觀察測試結果,然后在對成像拍照。針對來自8個擴增不同液體的植物葉綠體DNA的SSR引物,其反應體系為2 μL(5 U·μL-1) Taq DNA Polymerae、1μL(10μmol·L-1)Forword Primer、0.5μL×dNTP、1μL20ng/μL葉綠體DNA,加ddH2O到20μL。其反應程序如下:95 ℃ 5 min、95 ℃ 1 min,退火1 min,退火的溫度因物而異;72 ℃ 2 min,32次循環(huán),最后72 ℃ 10 min時,電泳檢測檢測PCR產物。

      2.3葉綠體的顯微觀察

      將1 mL BufferⅡ的溶液與葉綠體融合,并將其放在載玻片上,然后用蓋玻片將其蓋住,將其制成臨時裝片,采用100×油鏡觀察葉綠體。

      2.4CTAB的提取法

      將CTAB作為提取芒果基因組的DNA,有關研究學者采用這種方法在提取液當中加入PVP粉末和β-的巰基乙醇等一些抗氧化的試劑保護機體組的DNA,避免其與多酚類物質結合。還有的研究學者采用了24∶1的酚氯仿異戊醇混合液抽,經(jīng)過將CTAB提取液進行恒溫水浴后得到了清液,然后將其重復抽提2次,抽提的溶液和上清溶液兩者的體積比例是1∶1,在一般情況下采用飽和酚∶異戊醇∶氯仿=25∶1∶24混合的溶液對其進行抽取,而如果采用這種方法時將飽和酚去除,也能將芒果屬中的高質量基因組的DNA提取出來。

      2.5試劑盒提取

      采用康為世紀公司的Mango Gen DNA Kit的芒果基因組DNA提取試劑盒,將DNA提取出來,但通過紫外分光光度計檢測發(fā)現(xiàn)采用這種方法提出芒果基因組DNA的濃度相對較低,并且采用這種方式的投入較大、花費較高。對比試劑盒法、高鹽-低pH法、CTAB提取法提取植物葉綠體DNA的效果,采用DNAout試劑盒法能夠清除物質植被中的蛋白質、多糖、酚類等代謝物質,得出OD230/OD260>2.000,OD280/OD260約1.800,采用高鹽-低pH方法所提取的葉綠DNA的產率較高,高于75.8 ng·μg-1。

      2.6 檢測葉綠體DNA中的SSR

      采用葉綠體DNAout試劑盒、高鹽低PH的cpDNA等提取方法,并使用SSR引物,選出8對,擴增cpSSR數(shù)量,由此能夠得出采用cpDNA提取方法具有一定的可靠性。

      使用扁桃與芒果的cpDNA作為基本模板,使用引物來擴增PCR,通過驗證得出采用以上兩種方法能夠擴增出層次清晰、亮度更好、完整性較好的譜帶。由此能夠得出,采用這兩種方法在提取物質中cpDNA的濃度時較為理想,質量相對較高,能夠將其用于開展后期工作。

      2.7 顯微觀察芒果屬的植物葉綠體

      采用植物葉綠體的DNAout與高鹽-低pH檢測方法,能夠得出高純度、雜質少、背景清晰的葉綠體顯微成像,因此可以將這兩種方法應用于提取扁桃和芒果DNA葉綠體,但是采用高鹽-PH提出的葉綠體細胞的濃度較高。兩種提取方法的分析結果如表1所示。

      2.8 SDS提取

      使用高鹽的TE溶液,將0.8 mol·L-1 NaCl加入TE的溶液中,在溶液中加入NaCl能夠檢測樣品中的多糖含量,有效減少溶液中的其他物質造成干擾。通過提升SDS緩沖溶液的濃度,能夠有效減少提取基因組DNA的時間,并且也保障提取基因組DNA的質量。使用這種提取方法能夠不斷增加PCR的含量,但是產物的質量和效率可能會出現(xiàn)不同的結果。此外,也應該合理控制提取的時間與所研磨顆粒的粗細度。

      3 結果分析

      在研究葉綠體基因組的過程中,提取優(yōu)質的cpDNA是提取芒果屬的前提,采用葉綠體基因組提取方法與全基因組DNA的提取方法相比,cpDNA難度大。cpDNA存在于葉綠體的細胞中,分離難度大;線粒體DNA與核DNA提取cpDNA時,會受到干擾,從而制約了獲取cpDNA效率。在提取cpDNA時,獲得較為完整的葉綠體能保障cpDNA的獲取質量。也可在冰上操作,但要做好研缽經(jīng)液氮預冷工作,由此能減少組織的褐化程度,并保障葉片組織能夠充分凍結,保障葉綠體的完整性。高鹽-低pH的提取率較高,葉綠體DNAout的試劑盒方法操作較為簡單,提取出的cpDNA質量較好。采用這兩種方法都能獲得實驗所要求的cpDNA,從提取的產率角度來看,采用高鹽-低pH的實驗方法相對較好,但從操作簡單和提取質量的角度來看,采用葉綠體DNAout的試驗盒方法較好。

      [參考文獻]

      [1] 張宇,黃國弟,李日旺,等.芒果屬植物葉綠體DNA提取方法的研究[J].經(jīng)濟林研究,2017,35(3):50-54.

      [2] 謝海坤,焦健,樊秀彩,等.中國野生葡萄葉綠體分離及葉綠體DNA提取的研究[J].西北植物學報,2016,36(7):1464-1469.

      [3] 謝海坤,焦健,樊秀彩,等.基于高通量測序組裝‘赤霞珠葉綠體基因組及其特征分析[J].中國農業(yè)科學,2017,50(9):1655.

      [4] 黎金燕,王春暉,陳天帶,等.高鹽低pH法提取尾葉桉葉綠體DNA方法建立及質量分析[J].分子植物育種,2017(3):890-894.

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