復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物制備工藝及初步吸收評價

王景媛，史亞軍，黃維，王春龍

作者單位：陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046

冠心病主要是由冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞，導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病［1］。復(fù)方龍脈寧方是陜西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病科陶根魚教授的經(jīng)驗方，處方由葛根、川芎、穿山龍、蜂膠四味中藥組成，功能通絡(luò)活血，消炎化瘀，臨床應(yīng)用于冠心病的治療。雖然復(fù)方龍脈寧提取物的活性成分有確切的藥理效應(yīng)，但由于其水溶性、脂溶性均較差的特點造成了口服吸收較為困難，且藥物在體內(nèi)的生物利用度不高，從而極大地限制了藥物的臨床使用［2］。相關(guān)研究證明，磷脂復(fù)合物作為一種新型給藥系統(tǒng)，用于中藥有效部位的改性時可有效提高有效部位的脂溶性和水溶性［3］。本研究自2017年12月至2018年4月將復(fù)方龍脈寧提取物的制備工藝與磷脂復(fù)合物技術(shù)相結(jié)合，通過評價改性前后提取物和磷脂復(fù)合物在十二指腸段的吸收情況，以論證此工藝能改善復(fù)方龍脈寧的生物藥劑學特性［4］，對復(fù)方龍脈寧的生物利用度的提高做出理論支持。

1 材料

梅特勒-托利多AR114電子天平；78-1型磁力攪拌器；Thermo Scientific Heraeus Labofuge400R臺式離心機；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵。Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀。

SD大鼠由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供［合格證號：SYXK（陜）2017-014）］；葛根（批號20171226）、穿山龍（批號20171011）、川芎（批號20170907）均購自寶雞向源中藥飲片有限責任公司；蜂膠（陜西省咸陽市自然之子蜂產(chǎn)品公司，批號20170821）。葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110773-201612，純度≥98%）；大豆卵磷脂（上海太偉藥業(yè)，批號040801，PC≥82%）；復(fù)方龍脈寧提取物、復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物、Krebs-Ringers腸營養(yǎng)液為均為自制；乙腈、甲醇為色譜純（美國Fisher）；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純（天津科密歐試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物制備工藝

2.1.1復(fù)方龍脈寧提取物制備工藝［5］按原方比例取葛根，穿山龍，川芎三味藥材，用8倍量70%濃度的乙醇回流提取3次，每次2 h，提取完成后回收乙醇，提取液減壓濃縮至適量，采用大孔吸附樹脂法對提取液進行純化，樹脂型號為AB-8，提取液與樹脂比例為1 mL∶1 g，洗脫液為80%濃度乙醇，洗脫速度為0.5 BV/h，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮至適量后，按原方比例加入除蠟后的蜂膠，混勻，噴霧干燥，即得。

2.1.2磷脂復(fù)合物制備及評價［6］將“2.1.1”項下制得的復(fù)方龍脈寧提取物和一定量的磷脂置于圓底燒瓶中，加入一定量無水乙醇，將圓底燒瓶置于磁力攪拌器上進行恒溫攪拌，反應(yīng)一段時間后，減壓回收無水乙醇，將圓底燒瓶內(nèi)壁上的產(chǎn)物刮取下來，置于減壓干燥箱中干燥，得到復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物。

2.1.3復(fù)合率測定方法的建立［7］分別稱取已經(jīng)研磨成細分的復(fù)方龍脈寧提取物1 g于50 mL三角瓶中，分別加入表1中的試劑20 mL，置于室溫（25℃）下，每5 min強力震蕩30 s，持續(xù)30 min，濾過，濾液用恒重后的蒸發(fā)皿收集，置于80℃水浴鍋上烘干后，轉(zhuǎn)移至烘箱烘干至恒重，試驗結(jié)果見表1。

溶解率＝（W1-W2）/W3×100%，W1＝蒸發(fā)皿+溶解物質(zhì)量，W2＝蒸發(fā)皿質(zhì)量，W3＝龍脈寧提取物質(zhì)量。

從表1可得，復(fù)方龍脈寧提取物在甲苯中的溶解性較低，為0.7%，因此選擇甲苯作為測定復(fù)合率的溶劑。

利用龍脈寧提取物難溶于甲苯，而大豆卵磷脂和龍脈寧提取物磷脂復(fù)合物易溶于甲苯的特點［8］，將定量的龍脈寧提取物和大豆卵磷脂復(fù)合后，減壓除去反應(yīng)溶劑，取出，研磨成細粉，精密稱定1 g龍脈寧提取物磷脂復(fù)合物，將復(fù)合物置于錐形瓶中，充分溶解其中的磷脂及磷脂復(fù)合物，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取出，將上清液轉(zhuǎn)移至己恒重的蒸發(fā)皿中，除去甲苯，稱定其重量。復(fù)方龍脈寧提取物與大豆卵磷脂復(fù)合率（%）＝［M2-（M1-M2）×λ］/M1×100%（M1＝磷脂復(fù)合物質(zhì)量，M2＝磷脂復(fù)合物溶于甲苯的質(zhì)量，λ＝磷脂與藥物質(zhì)量比）。依照此法檢驗三批樣品，計算各樣品復(fù)合率的平均值，從而計算出復(fù)方龍脈寧與大豆卵磷脂的復(fù)合率。

表1 復(fù)方龍脈寧提取物在不同溶劑中的溶解度

2.1.4單因素實驗 復(fù)合率的影響因素包括復(fù)合溶劑的類型、復(fù)合的時間與溫度、藥脂比以及藥物的濃度，由于提取物與磷脂的復(fù)合實質(zhì)上是分子間的結(jié)合［9］，這就要求復(fù)方龍脈寧提取物在進行復(fù)合的溶劑中溶解度較高，結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，最終復(fù)合溶劑為無水乙醇，且復(fù)合率的影響因素為復(fù)合時間、藥物濃度以及藥脂比等，而復(fù)合溫度對復(fù)合效果的影響為低濃度時提取物與磷脂的復(fù)合率受反應(yīng)溫度的影響較小，而高濃度時提取物與磷脂的復(fù)合率則受反應(yīng)溫度影響較大，具體表現(xiàn)為溫度在40℃以上時復(fù)合率隨著溫度的增高而降低。

2.1.5正交實驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗的考察結(jié)果，選擇最佳反應(yīng)溶劑為乙醇、反應(yīng)溫度為40℃、高藥物濃度時，以藥物濃度（A）、藥脂比（B）和復(fù)合時間（C）做三因素三水平的正交實驗設(shè)計。采用L9（33）表，因素水平表見表2，結(jié)果見表3，4。

表2 因素水平表

表3 正交實驗結(jié)果

表4 方差分析表

由直觀分析可知，最佳工藝參數(shù)為A1B2C3，即藥物濃度為80 mg/mL，藥脂比為1∶3，反應(yīng)時間為12 h，方差分析結(jié)果顯示藥脂比以及反應(yīng)時間對結(jié)果無顯著性影響。按此優(yōu)化條件制得3批復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物，測得磷脂復(fù)合物的平均復(fù)合率為86.72%。

2.2 復(fù)方龍脈寧磷脂復(fù)合物十二指腸吸收研究以葛根素為指標，使用HPLC進行測定，采用外翻腸囊法研究復(fù)方龍脈寧提取物改性前后在十二指腸的吸收變化，以評價復(fù)方龍脈寧提取物改性前后的改善情況。

2.2.1色譜條件 色譜柱為Hypersil ODSC18（250mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（25∶75），檢測波長為250nm，流速為1mL/min，理論板數(shù)按葛根素峰計算應(yīng)不低于4 000。

2.2.2供試品溶液的配制 取葛根素對照品，用“2.2.1”項下流動相稀釋成濃度為0.051 2 mg/mL的葛根素溶液作為對照品儲備液。取過量復(fù)方龍脈寧提取物及磷脂復(fù)合物于錐形瓶中，加入Krebs-Ringers腸營養(yǎng)液，充分攪拌，得藥物飽和液，以3 000 r/min的速率離心10 min，取上清液，按照“2.2.1”項下色譜條件測定溶液中葛根素的含量，分別配置含量為0.1，0.5，1.0mg/mL的溶液作為供試品溶液。

2.2.3十二指腸吸收實驗 取受試SD大鼠禁食24 h，期間自由飲水，試驗時取10%水合氯醛將大鼠腹腔注射麻醉后，取出10 cm左右十二指腸，分離出腸系膜，用37℃Krebs-Ringers腸營養(yǎng)液將腸系膜沖洗干凈，翻轉(zhuǎn)十二指腸，結(jié)扎一端，固定另一端，加入Krebs-Ringers腸營養(yǎng)液飽和平衡5 min，將其放入“2.2.2”項下保持37℃恒溫的供試液中，保持氧及二氧化碳的供入，分別在0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3 h吸取0.2 mL腸囊內(nèi)溶液，同時向腸囊內(nèi)補充0.2mL Krebs-Ringers腸營養(yǎng)液，測定各時間點樣品中的葛根素含量。

2.2.4含量測定及數(shù)據(jù)處理 將各樣品置于離心機中，以3 000 r/min離心5 min，取上清液，按“2.2.1”項下色譜條件測定上清液中葛根素的含量，計算各樣品累計滲透量Q，以各樣品的Q測定值對時間進行零級、一級、Higuchi方程擬合，通過相關(guān)系數(shù)的計算確定數(shù)據(jù)處理模型。

上式中Q：單位面積的累積滲透量；V0：接收液體積（mL）；Cn：第n次取樣的藥物濃度；Vi：每次的取樣體積（mL）；Ci：第n-1次測得的藥物濃度）；A：離體十二指腸腸管吸收面積。

方法學試驗：分別精密吸取對照品儲備液4、8、10、12、16、20 μL進樣，以峰面積A對進樣量C（μg）進行回歸，得到回歸方程為A＝107x+106，R2＝0.999，結(jié)果表明，葛根素在0.2～1.02μg處線性關(guān)系良好。專屬性試驗顯示，葛根素峰分離良好，在空白樣品處沒有吸收，專屬性良好。精密度試驗顯示，連續(xù)進樣5次，葛根素峰面積RSD為0.96%；分別于0、2、8、12、24 h進樣，葛根素峰面積RSD為2.15%，儀器精密度良好，樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。對照品與供試品HPLC圖見圖1。

圖1 HPLC圖：A為葛根素對照品，B為復(fù)方龍脈寧提取物供試品

2.2.5樣品測定結(jié)果 對不同時間點兩種樣品的含量進行測定，將各樣品的累計滲透量對時間分別按照零級、一級、Higuchi進行擬合，結(jié)果表明以零級擬合最佳，這表明復(fù)方龍脈寧中的葛根素在十二指腸中表現(xiàn)出了被動擴散的吸收特征，不同濃度樣品測定結(jié)果見表5，將三個濃度條件下的累積吸收量對時間作圖，見圖2～4。

表5 不同濃度樣品測定結(jié)果（n＝5）

圖2 低濃度樣品吸收曲線（±s，n＝5）

圖3 中濃度樣品吸收曲線（±s，n＝5）

圖4 高濃度樣品吸收曲線（±s，n＝5）

結(jié)果表明，提取物的腸吸收累積量與樣品濃度呈現(xiàn)的正相關(guān)，吸收速度常數(shù)呈線性遞增，這表明復(fù)方龍脈寧中的葛根素為被動擴散吸收。復(fù)方龍脈寧提取物經(jīng)與磷脂復(fù)合后，葛根素的腸吸收量明顯增加，高、中、低三個濃度提升量分別為65%、60%和26%。結(jié)果表明，將磷脂復(fù)合物技與復(fù)方龍脈寧提取物相結(jié)合，可明顯改善復(fù)方龍脈寧中葛根素的十二指腸吸收，這對提高復(fù)方龍脈寧的生物利用度提供了理論依據(jù)。

3 討論

復(fù)方龍脈寧方主治心腦血管疾病，在臨床應(yīng)用廣泛，療效確切，本課題在前期研究中選擇了滴丸作為劑型，取得了一定的研究進展，但仍存在生物利用度低、用藥量大、用藥次數(shù)多等弊端。經(jīng)過方中各味藥有效成分分析，發(fā)現(xiàn)含有大量的黃酮類及其他含羥基成分，文獻研究表明，這些物質(zhì)與磷脂結(jié)合可改善其理化性質(zhì)及生物利用度［10］，為了改善原方中的有效成分不利于吸收的缺點，本研究結(jié)合磷脂復(fù)合物技術(shù)［11］，對復(fù)方龍脈寧提取物進行處理，使其與磷脂復(fù)合，復(fù)合率較高，改善了藥物在體內(nèi)的吸收，提高了藥物在體內(nèi)的生物利用度。

據(jù)文獻報道，葛根素單體的磷脂復(fù)合物復(fù)合率可達100%［2］，但考慮到中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性，以及提取物中含有其他不含羥基的化合物無法與大豆卵磷脂進行復(fù)合，86.72%的復(fù)合率已經(jīng)是一個較為理想的結(jié)果。本試驗的復(fù)合溶劑為無水乙醇，并且對復(fù)合效果具有一定影響的復(fù)合時間、藥物濃度以及藥脂比等因素進行了考察，從而確定了復(fù)合工藝為藥物濃度為80 mg/mL，藥脂比為1∶3，反應(yīng)時間為12h。

離體十二指腸吸收研究結(jié)果表明，磷脂復(fù)合物中葛根素的腸吸收情況相較原提取物顯著提高，吸收機制為被動擴散。但是，提取物與大豆卵磷脂復(fù)合后吸濕性增強，且給藥劑量、劑型選擇及藥物規(guī)格相應(yīng)改變，后續(xù)將對這些問題進行研究。