唐標(biāo) 唐文靜 鄧常清

摘要：目的? 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃芪和三七主要有效成分配伍抗缺血性腦損傷作用機制，為成分篩選提供參考。方法? 文獻(xiàn)檢索結(jié)合前期研究確定黃芪和三七抗缺血性腦損傷主要有效成分，通過DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫預(yù)測有效成分作用靶點，多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合檢索腦缺血相關(guān)疾病靶點。采用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)、作用靶點蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，交叉融合并篩選核心靶點。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點進(jìn)行生物過程和信號通路富集分析。結(jié)果? 篩選出的194個核心靶點主要關(guān)聯(lián)腦缺血凋亡、自噬、神經(jīng)營養(yǎng)因子的保護(hù)作用、血管新生及炎癥反應(yīng)等多個過程。此外，靶點參與了腦缺血中PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、血管新生途徑及多種炎癥反應(yīng)途徑。結(jié)論? 上述生物過程和通路介導(dǎo)了黃芪和三七主要有效成分抗缺血性腦損傷的潛在機制，可為成分篩選提供參考。

關(guān)鍵詞：黃芪;三七;腦缺血;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點;信號通路

中圖分類號：R277.73;R285??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）07-0109-05

Abstract： Objective To discuss the mechanism of compatibility of main active components of Astragali Radix and Notoginseng Radix et Rhizoma on cerebral ischemic injury through network pharmacology. Methods Main active components of Astragali Radix and Notoginseng Radix et Rhizoma for the treatment of cerebral ischemic injury were determined through literature search combined with preliminary experimental research. Through the DRAR-CPI database， main active components were predicted and collected， and the targets were associated with cerebral ischemia. In addition， targets for cerebral ischemia-related diseases were retrieved and collected by multiple data bases. Cytoscape 3.2.1 software was used to construct the active component-target network， target protein-protein interaction network and disease-related target protein-protein interaction network， and the two protein networkswere under cross-fusion and screening. The DAVID database was used to analyze the biological processes and pathways of core targets to predict the mechanism of action. Results The screened 194 core targets showed that the targets were associated with apoptosis， autophagy， neurotrophic factor protection， angiogenesis and inflammatory response. Furthermore， the targets were involved in PI3K-Akt signaling pathway， MAPK signaling pathway， neurotrophin signaling pathway， angiogenesis pathway， inflammatory response pathway of cerebral ischemia. Conclusion These biological processes and pathways mediated the underlying mechanisms of the main active components of Astragali Radix and Notoginseng Radix et Rhizoma against cerebral ischemic injury.

Keywords： Astragali Radix; Notoginseng Radix et Rhizoma; cerebral ischemia; network pharmacology; targets; signaling pathways

臨床上，腦卒中以缺血性腦卒中最為常見。黃芪和三七是治療心腦血管疾病的常用有效中藥，黃芪具有補氣升陽作用，三七具有活血散瘀、消腫定痛功效，二者常配伍使用。實驗研究表明，黃芪甲苷是黃芪中具有心腦血管效應(yīng)的主要藥效組分，三七總皂苷是三七中具有心腦血管效應(yīng)的主要藥效組分，主要含人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、和三七皂苷R1，黃芪甲苷和三七總皂苷均有明顯改善腦缺血損傷作用[1-2]。前期研究我們采用中藥組分配伍模式，研究了黃芪甲苷與三七中的人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1配伍的協(xié)同增效作用，發(fā)現(xiàn)配伍后可通過腦缺血后的多個病理生理環(huán)節(jié)，協(xié)同對抗缺血性腦損傷[3-7]。為進(jìn)一步揭示黃芪和三七主要有效成分配伍協(xié)同抗腦缺血損傷作用機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理方法，從分子作用網(wǎng)絡(luò)探討黃芪和三七有效成分配伍抗缺血性腦損傷作用靶點及其關(guān)聯(lián)通路，為成分篩選提供參考。

1? 資料與方法

1.1? 主要有效成分選擇

結(jié)合文獻(xiàn)報道和課題組前期研究，選擇黃芪和三七中具有抗缺血性腦損傷作用的主要有效成分黃芪甲苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的候選有效成分，通過Pub Chem（有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫，http：//pubchem.ncbi. nlm.nih.gov）檢索有效成分，收集結(jié)構(gòu)和相關(guān)信息，建立有效成分?jǐn)?shù)據(jù)集。

1.2? 有效成分作用靶點預(yù)測與疾病靶點收集

DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫是以CPI（chemical-protein interactome）為方法學(xué)的預(yù)測數(shù)據(jù)庫，以小分子為研究對象，基本涵蓋全部上市藥物和全部的人類可藥性蛋白，得到一系列靶藥結(jié)合強度的矩陣并形成一個結(jié)合譜，用于尋找小分子和FDA所批準(zhǔn)藥物間的相似性，進(jìn)而挖掘“藥物-藥靶”關(guān)系，數(shù)據(jù)庫通過計算輸入化合物與數(shù)據(jù)庫蛋白的對接情況，預(yù)測能與化合物相互作用的靶蛋白。通過DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫（https：//cpi.bio-x.cn/drar/）基于反向分子對接方法預(yù)測有效成分的作用靶點，在線輸入分子結(jié)構(gòu)后收集和建立作用靶點數(shù)據(jù)集。將預(yù)測到的作用靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，并將所有靶基因名稱校正為其官方名稱，設(shè)定閾值P<0.05進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集初步分析和KEGG代謝通路富集初步分析，分析作用靶點的潛在作用。通過TTD（http：// bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、Drugbank（https：//www. drugbank.ca/）、OMIM（http：//www.omim.org/）、CTD（http：//ctdbase.org/）聯(lián)合檢索腦缺血疾病相關(guān)靶點，檢索詞為“Brain Ischemia”或“Cerebral Infarction”或“Hypoxia- Ischemia， Brain”或“Cerebral ischemia”，其中TTD數(shù)據(jù)檢索到18個靶點，Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索到12個靶點，OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到82個靶點，CTD數(shù)據(jù)庫檢索到有實驗驗證的靶點95個。去除重復(fù)靶點，導(dǎo)入Uniprot（http：// www.Uniprot.org/），通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，剔除非人源靶點，并將所有靶基因名稱校正為其官方名稱，建立疾病相關(guān)靶點數(shù)據(jù)集。

1.3? 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

采用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape插件Bisogenet3.0.0，根據(jù)Bisogenet中的蛋白相互作用（PPI）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，數(shù)據(jù)設(shè)置選擇蛋白與蛋白的相互作用，方法選擇輸入所有節(jié)點和所有的鄰居，輸出選擇基因。網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的拓?fù)鋵W(xué)特征通過Cytoscape的插件CytoNCA計算參數(shù)來評價，參數(shù)分別為度中心性（DC）、中間中心性（BC）、接近中心性（CC），這3個參數(shù)是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中評價網(wǎng)絡(luò)節(jié)點重要性的核心參數(shù)，值越大說明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越接近網(wǎng)絡(luò)中心位置。參照文獻(xiàn)[8]篩選方法，以DC、BC和CC對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行評價和篩選。

1.4? 靶點的生物過程和通路富集分析

基因富集分析是指將基因按照先驗知識，按照基因組注釋信息進(jìn)行分類。采用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的核心靶點進(jìn)行基因的生物學(xué)過程和代謝通路的初步富集分析[9]。通過基因的富集分析預(yù)測有效成分配伍抗缺血性腦損傷的可能機制。

2? 結(jié)果

2.1? 靶點預(yù)測與收集

通過DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫預(yù)測4種有效成分靶點，共收集到80個靶點，其中黃芪甲苷的作用靶點66個，人參皂苷Rb1作用靶點5個，人參皂苷Rg1的作用靶點34個，三七皂苷R1的作用靶點24個。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對作用靶點進(jìn)行基因的生物學(xué)過程和代謝通路的初步富集分析，結(jié)果表明，靶點參與的主要生物過程中凋亡的調(diào)控（10個，13.5%）和氧化還原反應(yīng)（9個基因，12.1%）為缺血性腦損傷的核心過程。另外預(yù)測靶點主要參與的與腦缺血有關(guān)的通路為代謝通路、MAPK信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、cAMP信號通路、mTOR信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、AMPK信號通路及凋亡途徑。富集分析結(jié)果表明，預(yù)測靶點與腦缺血密切關(guān)聯(lián)，有潛在抗缺血性腦損傷作用。此外，通過多數(shù)據(jù)聯(lián)合關(guān)鍵詞檢索的方式檢索到腦缺血疾病相關(guān)靶點，包括TTD數(shù)據(jù)庫18個、Drugbank數(shù)據(jù)庫12個、OMIM數(shù)據(jù)庫82個，CTD數(shù)據(jù)庫檢索到有實驗驗證的95個靶點。剔重后得到腦缺血相關(guān)靶點199個。

2.2? 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

構(gòu)建的有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)包含84個節(jié)點、129條邊，見圖1。可見1個活性成分可作用于多個靶點，多個活性成分可作用于同一靶點，體現(xiàn)了有效成分多靶點的協(xié)同作用特點。

構(gòu)建作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。80個作用靶點生成的PPI網(wǎng)絡(luò)包含2963個節(jié)點、64 362條邊。199個疾病靶點生成的PPI網(wǎng)絡(luò)包含4348個節(jié)點、102 093條邊。采用Cytoscape的融合工具對2個PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行交叉融合，篩選共有網(wǎng)絡(luò)，得到的共有網(wǎng)絡(luò)包含1723個節(jié)點、43 979條邊。采用CytoNCA計算網(wǎng)絡(luò)的DC、BC和CC值并進(jìn)行2次篩選。第一次以DC>68（2倍中位數(shù)）作為篩選指標(biāo)，得到的初篩網(wǎng)絡(luò)包含410個節(jié)點、15 215條邊。采用DC>66.5、BC>0.001 22、CC>0.543 161進(jìn)行第二次篩選，得到的核心網(wǎng)絡(luò)包含194個節(jié)點、6105條邊，194個靶點即為黃芪和三七主要有效成分配伍抗缺血性腦損傷的核心靶點。

2.3? 靶點生物過程和通路富集分析

初步富集分析結(jié)果表明，靶點參與的生物過程為RNA聚合酶Ⅱ啟動子的調(diào)控、凋亡的調(diào)控、基因表達(dá)、細(xì)胞黏附、蛋白磷酸化調(diào)控、蛋白泛素化調(diào)控、MAPK復(fù)合物調(diào)控、NF-κB信號通路調(diào)控、ERK1和ERK2復(fù)合物調(diào)控、自噬調(diào)控、Wnt信號通路調(diào)控、Toll樣受體信號通路調(diào)控、JNK復(fù)合物調(diào)控（見圖2A）。其中凋亡、自噬均為腦缺血損傷的關(guān)鍵過程[10]，MAPK、ERK、Wnt、Toll樣受體和NF-κB信號通路為腦缺血損傷中的關(guān)鍵通路[11]。此外，靶點主要參與了PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路、ErbB信號通路、HIF-1信號通路、cAMP信號通路、TGF-β信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、Wnt信號通路、NF-κB信號通路和凋亡途徑（見圖2B）。通路富集具體結(jié)果見表1。在這些通路中，PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路為腦缺血的核心通路，可調(diào)控腦缺血的多個過程，如氧化應(yīng)激、自噬、凋亡、炎癥反應(yīng)[12];神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路和ErbB信號通路主要調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子對腦缺血的保護(hù)作用[13];TGF-β信號通路有抗氧化、阻止細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腦缺血組織修復(fù)的多種作用;Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路和NF-κB信號通路為腦缺血中重要炎癥反應(yīng)通路[14];HIF-1信號通路和Wnt信號通路主要調(diào)節(jié)腦缺血中血管新生[15]。綜合富集分析結(jié)果，預(yù)測黃芪和三七有效成分配伍抗缺血性腦損傷的機制主要為：①黃芪和三七有效成分配伍通過調(diào)控包括凋亡和自噬在內(nèi)的多種細(xì)胞死亡方式、神經(jīng)營養(yǎng)因子的保護(hù)作用、血管新生、炎癥反應(yīng)發(fā)揮對缺血性腦損傷的保護(hù)作用;②PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、血管新生途徑，以及包括Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路和NF-κB信號通路在內(nèi)的炎癥反應(yīng)途徑介導(dǎo)了黃芪和三七有效成分配伍的抗缺血性腦損傷潛在機制。

3? 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合了系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)、多向量藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等學(xué)科技術(shù)，從整體角度揭示藥物與疾病的關(guān)聯(lián)，為中藥作用的多靶點、多途徑效應(yīng)提供了可量化數(shù)據(jù)，廣泛應(yīng)用于單味藥多成分或復(fù)方作用機制及有效成分配伍研究。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對黃芪和三七的4種有效成分進(jìn)行靶點預(yù)測，共收集到80個作用靶點，靶點的初步富集分析表明靶點與腦缺血密切關(guān)聯(lián)，且在有效成分和作用靶點的對應(yīng)中，存在1種有效成分對應(yīng)多靶點、同一靶點對應(yīng)多種有效成分的現(xiàn)象，體現(xiàn)了黃芪和三七有效成分配伍的多靶點協(xié)同作用機制，在一定程度上揭示了二者配伍的科學(xué)內(nèi)涵。此外，通過多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合檢索收集到腦缺血的199個疾病靶點，采用Bisogenet構(gòu)建作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，并對2個網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行交叉融合篩選出共有網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選方法對共有網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行兩次篩選，篩選出核心網(wǎng)絡(luò)，得到黃芪和三七有效成分配伍抗腦缺血的194個核心靶點。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點進(jìn)行基因的生物學(xué)過程和代謝通路的初步富集分析，通過文獻(xiàn)檢索分析結(jié)果與腦缺血的關(guān)聯(lián)性，預(yù)測黃芪和三七有效成分配伍抗缺血性腦損傷的可能機制主要為：①調(diào)控腦缺血中包括凋亡和自噬在內(nèi)的多種細(xì)胞死亡方式、神經(jīng)營養(yǎng)因子的保護(hù)作用、血管新生、炎癥反應(yīng);②調(diào)控腦缺血中的PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、血管新生途徑及多種炎癥反應(yīng)途徑。

目前認(rèn)為，缺血性腦損傷的病理機制復(fù)雜，涉及多種生物活性分子及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如活性氧大爆發(fā)、一氧化氮生物利用率減少、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥、細(xì)胞凋亡及自噬等。前期研究表明，黃芪和三七主要有效成分配伍可通過NF-κB信號通路抑制炎癥和凋亡[5]，通過PI3KⅠ/Akt/mTOR通路調(diào)控腦缺血自噬過程[16]，這與預(yù)測結(jié)果相符，為本研究預(yù)測機制提供了數(shù)據(jù)參考，也表明預(yù)測結(jié)果較準(zhǔn)確。此外，預(yù)測結(jié)果表明，炎癥反應(yīng)調(diào)控是預(yù)測機制的核心，而炎癥反應(yīng)在腦缺血的發(fā)生發(fā)展中也起到重要作用，炎癥反應(yīng)參與腦缺血的病理生理學(xué)過程，并在腦缺血中起“雙刃劍”作用，在缺血早期加重缺血性腦損傷，又參與組織的修復(fù)和再生。研究表明，腦缺血中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞死亡的炎癥機制，主要是NOD樣受體信號通路中的炎癥小體介導(dǎo)，且炎癥小體通路接受NF-κB和MAPK通路的調(diào)控，實驗研究表明，在腦缺血中，炎癥小體各組成蛋白表達(dá)增加，炎癥小體活化產(chǎn)物Caspase-1、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-18水平升高，且NF-κB和MAPK通路介導(dǎo)腦缺血中炎癥小體的活化，抑制NF-κB和MAPK通路及炎癥小體均可減少腦缺血損傷[17-18]。腦缺血中NF-κB和MAPK通路介導(dǎo)的炎癥小體活化可能為黃芪和三七主要有效成分配伍抗腦缺血損傷的重要機制。但黃芪和三七主要有效成分配伍對腦缺血中核心過程和通路的調(diào)節(jié)作用，還需進(jìn)一步實驗研究驗證。

綜上，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析黃芪和三七有效成分配伍抗缺血性腦損傷的作用機制，預(yù)測了核心靶點及其可能的作用機制，初步揭示了黃芪和三七有效成分配伍抗缺血性腦損傷的多靶點-多途徑作用特點，可為進(jìn)一步深入研究其作用機制及成分篩選提供參考。

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