劉英輝，周東方，金國華，閆文昭，程 欣

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊 050000)

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是可由多種原因引起的危重疾病，主要臨床表現(xiàn)多為同時(shí)出現(xiàn)凝血機(jī)制障礙、黃疸、腹水等癥候[1]。ALF具有隱匿性強(qiáng)、發(fā)病迅速等特點(diǎn)，雖然發(fā)病率較低，然而目前尚缺乏特異性的治療措施，致死率很高，引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[2]。ALF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病理基礎(chǔ)是肝臟細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)大量死亡，導(dǎo)致肝臟合成、解毒、轉(zhuǎn)化等能力發(fā)生功能性障礙或失代償[3]。研究表明，在細(xì)胞凋亡過程中，磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路對(duì)相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用，可將膜受體信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，來實(shí)現(xiàn)維持細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡過程[4]。作為Akt的底物，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵元件[5]。葛根作為我國傳統(tǒng)名貴的中草藥，具有多種活性成分，其中葛根素除具有提高免疫、增強(qiáng)心肌收縮力，保護(hù)心肌細(xì)胞，降血壓等作用外，對(duì)肝損傷的保護(hù)作用也已廣泛報(bào)道[6]。但葛根素(puerarin，Pue)對(duì)D-氨基半乳糖所致的急性肝衰竭小鼠肝臟的保護(hù)作用機(jī)制，目前尚鮮見報(bào)道。因此本研究采用D-氨基半乳糖誘導(dǎo)急性肝衰竭小鼠模型，探討葛根素對(duì)肝臟的保護(hù)作用，同時(shí)分析其對(duì)PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究相關(guān)機(jī)制提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年雄性昆明小鼠50只，體重在(20±5)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司 [SCXK(京)2011-0011]，所有動(dòng)物均在本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)[SYXK(冀)2015-0042]。動(dòng)物的使用及操作按照本院動(dòng)物管理委員會(huì)(IACUC2017-002) 的規(guī)定執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)過程中遵守3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

葛根素(批號(hào)：070319812，純度> 98%)購自昆明制藥廠，用前以生理鹽水稀釋(pH 7.0)，根據(jù)體重計(jì)算給藥體積，4℃保存；丙二醛(malondialdehyde，MDA)(批號(hào)：SGA103)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批號(hào)：SE103)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)(批號(hào)：SA625)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransfease,，ALT)(批號(hào)：2017030928)，天門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)(批號(hào)：2017110812)，總膽紅素(total bilirubin，TBil)(批號(hào)：2017210612)，試劑盒購自上海瀚鴻化工科技有限公司；TUNEL試劑盒(批號(hào)：C503028)購自德國羅氏公司；LY294002(批號(hào)：BE28491)購自瀚香生物科技有限公司；D-氨基半乳糖(批號(hào)：AP1062)購自美國 Sigma 公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(20170212)、DAB化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)：D29183874)、P-Akt(批號(hào)：E289180)、P-GSK-3β (批號(hào)：A1209300)、cleaved caspase-3 (批號(hào)：A1805603) 抗體均購自上海仁捷生物科技有限公司。萬濠VTM-4030光學(xué)顯微鏡，上海長島生物技術(shù)有限公司AVDIA2400全自動(dòng)生化反應(yīng)儀檢。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及模型制備

將50只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為5組，每組10只：(1)正常對(duì)照組；(2)模型組；(3)Pue組(300 mg/kg)；(4)P13 K特異性抑制劑LY294002組(LY，10 mg/kg)；(5)Pue(300 mg/kg)聯(lián)合LY294002(10 mg/kg)組(Pue+LY組)。Pue組、LY組及Pue+LY組造模前根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要給予相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)給藥兩周，給藥方式為尾部靜脈注射，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組均以同樣方式注射等量無菌生理鹽水。末次給藥后禁食24 h，除正常組外，其他組腹腔注射10% D-氨基半乳糖(1.2 mL /100 g)造模，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.3.2 血清及肝臟生化指標(biāo)檢測

建模后8 h，采集各組小鼠靜脈血，引頸處死小鼠后固定，沿腹中線切開腹壁，暴露腹腔組織，小心分離肝臟。常規(guī)分離靜脈血血清，4 h內(nèi)采用全自動(dòng)生化反應(yīng)儀檢測小鼠ALT、AST、TBil、Alb肝功能指標(biāo)。準(zhǔn)確稱量部分肝臟組織，加入預(yù)冷的PBS緩沖液制成 10% 勻漿，4℃下4000 r/min離心10 min，取上清依據(jù)SOD、GSH-Px和MDA檢測試劑盒說明書所示的操作方法進(jìn)行測定，并計(jì)算每克肝組織中的活性或含量。

1.3.3 HE染色觀察小鼠肝臟組織形態(tài)變化

切取部分肝臟右葉，采用4%的甲醛固定24 h后進(jìn)行常規(guī)脫水和石蠟包埋，將小鼠肝臟組織石蠟塊切成5 μm厚度的切片，進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織學(xué)改變。

1.3.4 TUNEL 法檢測肝臟細(xì)胞凋亡

取小鼠部分肝臟組織切片按試劑盒步驟進(jìn)行TUNEL染色。主要步驟為切片脫蠟水化后，蛋白酶 K(10 mmol/L)處理 20 min，PBS 清洗 5 min×3 次，將載玻片浸入 TUNEL 反應(yīng)混合物在37℃下避光溫育60 min，PBS 清洗5 min×3 次；在 37℃ 下，用 POD 反應(yīng)液避光溫育30 min；PBS 清洗 5 min×3 次；滴加 DAB 底物溶液顯色，室溫孵育 10 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞凋亡情況。以顯示藍(lán)色的核染色為正常細(xì)胞，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)。凋亡細(xì)胞所占百分比(凋亡率)：每只小鼠取 4 張切片，每張切片在200 倍視野下隨機(jī)選取 3 個(gè)不重疊視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例，取平均值即為細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 Western blot法檢測肝臟組織中P-Akt、P-GSK-3β、cleaved caspase-3表達(dá)的影響

取小鼠部分肝臟組織加入RIPA組織裂解液中勻漿器打碎，冰浴5 min后離心，離心條件：13000 r/min，4℃，時(shí)間10 min，獲得上清，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行上清中蛋白濃度的定量檢測，用2×電泳緩沖液稀釋蛋白至相同濃度。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，用Tris/甘氨酸緩沖液將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% TBST液中室溫封閉2 h，將PVDF膜放入相應(yīng)一抗稀釋液(均為1∶1000)中孵育，4℃過夜。次日，將膜取出，TBST液洗滌10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(均為1∶10 000)，室溫孵育2 h，加入DAB發(fā)光液，凝膠成像儀下讀取讀取灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)ALF小鼠肝功能的影響

血清 ALT、AST、Tbil水平是臨床反映肝細(xì)胞損傷和壞死程度的敏感指標(biāo)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠ALT、AST、Tbil指標(biāo)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，經(jīng)Pue預(yù)處理后，與模型組相比，Pue組肝功能指標(biāo)出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，LY組、Pue+LY組與模型組相比組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表1。

表1 葛根素對(duì)ALF小鼠肝功能的影響

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.

2.2 葛根素對(duì)ALF小鼠肝臟病理的影響

HE 染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列有序，細(xì)胞核體積較大，具有明確的核染色和正常的形態(tài)，并沒有發(fā)生損傷壞死現(xiàn)象；模型組小鼠肝臟細(xì)胞變小、變圓，有小的、質(zhì)密不規(guī)則的固縮核為死亡的肝臟細(xì)胞；Pue可明顯減少肝臟細(xì)胞丟失，改善細(xì)胞異常形態(tài)；LY組、LY+Pue組小鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)與模型組相似。見圖1。

注：A：正常對(duì)照組，B：模型組，C：Pue組，D：LY組，E：Pue+LY組。圖1 葛根素對(duì)ALF小鼠肝臟病理的影響(×200)Note. A， Normal group. B， model group. C， Pue group. D， LY group. E， Pue+LY group.Figure 1 Effects of puerarin on liver pathology of the ALF mice

注：A：正常對(duì)照組，B：模型組，C：Pue組，D：LY組，E：Pue+LY組。與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，與模型組相比，#P<0.05。圖2 葛根素對(duì)ALF小鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL染色)Note. A， Normal group. B， Model group. C， Pue group. D， LY group. E， Pue+LY group. Compaed with the normal control group, *P< 0.05. Compared with the model group, # P< 0.05.Figure 2 Effect of puerarin on the hepatocyte apoptosis in ALF mice. TUNEL staining

2.3 葛根素ALF小鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響

ALF小鼠肝臟經(jīng)過TUNEL法染色在光鏡下觀察呈棕色，如圖2所示，正常對(duì)照組肝臟細(xì)胞并未出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，Pue組小鼠肝臟細(xì)胞凋亡明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LY組、Pue+LY組與模型組相比組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 葛根素對(duì)ALF小鼠肝臟組織中氧化應(yīng)激的影響

SOD、GSH-Px和MDA作為機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的代表物質(zhì)，本研究檢測了ALF小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px和MDA 的水平，結(jié)果顯示和正常對(duì)照組相比，模型組中SOD、GSH-Px水平出現(xiàn)明顯的降低，MDA水平明顯的升高(P<0.05)；與模型組相比，Pue組中SOD、GSH-Px水平出現(xiàn)明顯的升高，MDA水平明顯的降低(P<0.05)；LY組、Pue+LY組小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px和MDA 的水平與模型組相比，差異無具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.5 葛根素對(duì)ALF小鼠肝臟組織中P-Akt、P-GSK-3β及cleaved caspase-3表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步觀察Pue對(duì)ALF小鼠模型肝臟的保護(hù)作用機(jī)制，本研究采用蛋白免疫印跡法檢測了肝臟組織中Akt、GSK-3β和cleaved caspase-3蛋白磷酸化水平，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，模型組中Akt、GSK-3β磷酸化水平明顯下降(P<0.05)，cleaved caspase-3明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，Pue組小鼠肝組織中Akt、GSK-3β磷酸化明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，cleaved caspase-3明顯下降(P<0.05)，LY組、Pue+LY組與模型組相比組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，與模型組相比，#P<0.05。圖3 葛根素對(duì)ALF小鼠肝臟組織中氧化應(yīng)激的影響Note. Compared with the normal control group, *P< 0.05. Compared with the model group, #P < 0.05.Figure 3 Effect of puerarin on oxidative stress in the liver tissues of ALF mice

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，與模型組相比，#P<0.05。圖4 Pue對(duì)ALF小鼠肝臟組織中P-Akt、P-GSK-3β、cleaved caspase-3表達(dá)的影響Note. Compared with the normal control group, *P < 0.05. Compared with the model group, #P < 0.05.Figure 4 Effects of Pue on the expression of p-akt, p-gsk-3 and cleaved caspase-3 in the liver tissues of ALF mice

3 討論

ALF是以肝功能迅速惡化為臨床特點(diǎn)的急性綜合征[7]?；加新愿窝?、肝纖維化等慢性肝病的患者可在勞累、飲酒、病毒感染等誘因下出現(xiàn)肝臟大面積死亡直至衰竭，其中以感染最為多見[8]，治療困難，給患者家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)。研究ALF疾病的發(fā)展規(guī)律、促進(jìn)臨床治療及肝臟組織修復(fù)一直以來是科學(xué)界研究的熱點(diǎn)之一。

現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，Pue可以提高自身免疫力，降血脂等多種生物學(xué)功能[9]，隨著研究的深入，Pue對(duì)肝臟細(xì)胞損傷方面的研究逐漸增多。金若天等[10]采用透射電鏡發(fā)現(xiàn)Pue預(yù)處理可以顯著降低肝臟缺血再灌注損傷后大鼠肝細(xì)胞凋亡率。另有報(bào)道，通過研究Pue對(duì)葛根素對(duì)四氯化碳所誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的肝臟的影響，發(fā)現(xiàn)Pue對(duì)于肝臟組織中caspase-9蛋白的表達(dá)具有顯著的抑制作用，且通過TUNEL染色法發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞凋亡率明顯減少，提示Pue對(duì)于多種原因引起的肝細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用[11]。本研究通過D-氨基半乳糖誘導(dǎo)ALF小鼠模型研究Pue的藥理作用，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝功能指標(biāo)明顯降低，且肝臟組織細(xì)胞凋亡數(shù)目增多。本研究根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇Pue給藥濃度，結(jié)果表明，經(jīng)過Pue預(yù)處理的小鼠與模型組相比，減輕D-氨基半乳糖對(duì)肝功能的損傷程度，肝細(xì)胞凋亡受到抑制，與既往研究結(jié)果一致。

細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過一系類復(fù)雜的信號(hào)傳遞實(shí)現(xiàn)了機(jī)體生物學(xué)行為，PI3K/Akt信號(hào)通路通過胞內(nèi)信號(hào)傳遞在細(xì)胞遷移、動(dòng)員、分化和抗凋亡等細(xì)胞生存調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要的作用，在近年來的研究中越來越受到重視[12]。LY294002是公認(rèn)的PI3K抑制劑，可特異性抑制PI3K110亞基單元的活性，阻斷PI3K介導(dǎo)的信號(hào)通路[13]。本研究中使用LY294002驗(yàn)證Pue對(duì)PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路的調(diào)節(jié)保護(hù)D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的ALF的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，Akt和GSK-3β磷酸化水平在Pue組與模型組相比大幅增加，而Pue+LY組較Pue組下降明顯，LY294002逆轉(zhuǎn)了Pue介導(dǎo)的Akt和GSK3β磷酸化水平，提示Pue可通過PI3K來實(shí)現(xiàn)Akt和GSK3β磷酸化進(jìn)程。有研究表明[14]，PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路抑制肝臟細(xì)胞的凋亡，同時(shí)在后期參與了其修復(fù)過程，從而對(duì)肝臟生理功能起到保護(hù)作用。與Pue組相比，Pue+LY組小鼠肝功能明顯降低，且肝細(xì)胞凋亡的數(shù)量增加，提示Pue可能是通過調(diào)控PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白激酶家族(caspases) 在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，caspase可將自身底物水解傳遞至凋亡通路，引起蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[15]。cleaved caspase-3是caspases 級(jí)聯(lián)反應(yīng)中下行的最關(guān)鍵蛋白酶，在凋亡程序中起到中樞作用[16]。本研究ALF小鼠經(jīng)Pue預(yù)處理后檢測cleaved caspase-3的表達(dá)，結(jié)果顯示，cleaved caspase-3出現(xiàn)下調(diào)，提示Pue抑制D-氨基半乳糖誘導(dǎo)所致ALF小鼠肝細(xì)胞凋亡可能是通過下調(diào)cleaved caspase-3來實(shí)現(xiàn)的。與Pue組相比，Pue+LY組cleaved caspase-3表達(dá)明顯增加，說明該作用機(jī)制與PI3K/Akt通路有關(guān)。

文獻(xiàn)報(bào)道稱[17]，PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路可介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。Lee等[18]研究發(fā)現(xiàn)，隨著GSK-3β磷酸化水平的升高，血清中SOD活性和 GSH/GSSG 的比值隨之增高，同時(shí)MDA含量下降，通過GSK-3β抑制劑(TDZD-8) 處理后，抗氧化作用被明顯逆轉(zhuǎn)。而氧化應(yīng)激在ALF的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19]。肝臟組織在自由基的作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化，生成MDA等物質(zhì)，嚴(yán)重者會(huì)造成肝組織細(xì)胞的DNA損傷[20]。本研究中，模型組昆明小鼠肝臟組織因注射D-氨基半乳糖，其肝組織中SOD活性和 GSH-Px 含量明顯降低，而MDA的含量明顯上升，說明D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的ALF模型小鼠機(jī)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并對(duì)小鼠肝組織造成氧化性損傷。Pue組可以明顯改善小鼠肝組織中SOD、GSH-Px和MDA水平，而LY組、Pue+LY組氧化應(yīng)激指標(biāo)與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示Pue會(huì)減輕D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的ALF小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)而對(duì)肝臟起到保護(hù)作用，可能與GSK-3β信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，Pue可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，從而減輕肝功能的損傷程度，抑制肝臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，發(fā)揮對(duì)D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的ALF小鼠肝臟的保護(hù)作用。但Pue是否還能通過調(diào)節(jié)其他通路來影響疾病進(jìn)程，仍需進(jìn)一步的研究。