王笑，李圓圓，孫志強(qiáng)，吳明澤，高鵬，代龍

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，山東 德州 251200)

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁ViolayedoensisMakino的干燥全草，主要用于抗菌消炎、清熱解毒、涼血消腫[1-2]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，紫花地丁臨床上可用于治療血栓、呼吸系統(tǒng)疾病及艾滋病等，其主要化學(xué)成分為秦皮乙素，是香豆素類化合物，具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用[3]。紫花地丁藥效多，臨床應(yīng)用廣泛，而且分布廣、資源豐富,是很有開發(fā)前景的一味中藥。但目前市場上出現(xiàn)較多易混品，如犁頭草、紫花堇菜等，與紫花地丁為同科同屬植物，外觀性狀上難以區(qū)別[4-5]。紫花地丁藥材及其混淆品的HPLC 指紋圖譜[6]，以及高效液相色譜法測定紫花地丁中某一成分的研究已有報(bào)道。目前的指紋圖譜分析未對主要成分峰進(jìn)行歸屬，無法全面反應(yīng)藥材的內(nèi)在質(zhì)量，而且《中國藥典》[7]中沒有建立藥材的含量控制指標(biāo)。因此，本文對不同產(chǎn)地紫花地丁中秦皮乙素的含量進(jìn)行研究，建立了紫花地丁藥材特征圖譜，為紫花地丁藥材標(biāo)準(zhǔn)化種植及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全面提升提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 藥材

紫花地丁ViolayedoensisMakino均采自不同產(chǎn)地，經(jīng)濟(jì)南市藥檢所宋希貴主任藥師鑒定為紫花地丁，均為人工種植藥材。藥材主要來源于山東、河南、山西、安徽4個(gè)省份，見表1。

表1 紫花地丁藥材來源信息

1.2 儀器與試劑

LC-2030高效液相色譜儀(日本島津制作所)；Mettler Toledo XS105電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KDM型可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

色譜甲醇、色譜乙腈(Sigma-Alorich)；秦皮乙素(110741-201708)對照品(中國食品藥品檢定研究院)；東莨菪內(nèi)酯(110768-200504)對照品(中國食品藥品檢定研究院)；木犀草素(111520-201605)對照品(中國食品藥品檢定研究院)，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 紫花地丁中秦皮乙素含量測定

2.1.1 紫花地丁供試品溶液的制備

取紫花地丁粗粉0.4 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，以60%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.1.2 色譜條件

色譜柱：Kinetex OOD-C18(100 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液，梯度洗脫程序見表2。流速1 mL·min-1；檢測波長350 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表2 HPLC梯度洗脫程序表

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取秦皮乙素對照品17.07 mg、東莨菪內(nèi)酯對照品11.27 mg、木犀草素對照品12.03 mg，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于4 ℃冰箱保存。

2.1.4 方法學(xué)考察

(1)線性關(guān)系考察

取秦皮乙素對照品適量，精密稱定17.07 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為貯備液(0.682 8 g·L-1)。精密量取貯備液1、2、3、4、5、6 mL，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。分別進(jìn)樣5 μL，測得峰面積，計(jì)算回歸方程[8]。

(2)精密度實(shí)驗(yàn)

取秦皮乙素對照品溶液68.28 μg·mL-1，進(jìn)樣5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積值。

(3)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品約0.4 g，精密稱定，按2.1.1的制備方法，制備供試品溶液，分別測定在不同時(shí)間的峰面積。

(4)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取樣品0.4 g，取6份，精密稱定，按2.1.1的制備方法，制備供試品溶液，測定。

(5)加樣回收實(shí)驗(yàn)

取紫花地丁藥材(已知秦皮乙素含量為7.22 mg·g-1)6份，每份約0.2 g，精密稱定，分別精密加入秦皮乙素對照品的甲醇溶液各50 mL，按2.1.1的制備方法，制備供試品溶液，測定。

2.1.5 樣品測定

取15個(gè)批次的紫花地丁藥材粗粉各0.4 g，精密稱定，按2.1.1項(xiàng)下方法制備樣品溶液，測定秦皮乙素的含量，每個(gè)批次平行測定2份，計(jì)算其含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x±δSD表示，用Graphpad軟件進(jìn)行分析，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。

2.2 紫花地丁藥材特征圖譜

2.2.1 方法學(xué)考察

(1)精密度實(shí)驗(yàn)：取同一批次紫花地丁供試品溶液，按給定色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)對精密度實(shí)驗(yàn)的圖譜進(jìn)行分析，計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間與相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察儀器的精密度。

(2)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：按2.1.1項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，按給定色譜條件進(jìn)行測定，同上法進(jìn)行分析，考察實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性。

(3)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一批次供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)行檢測，同上法進(jìn)行分析，考察樣品的穩(wěn)定性[9-10]。

2.2.2 建立紫花地丁藥材特征圖譜

依次測定15批紫花地丁藥材供試品溶液，采用高效液相色譜儀記錄20 min的色譜圖，即得。根據(jù)15批次紫花地丁藥材供試品測定結(jié)果所顯示的峰個(gè)數(shù)、相對保留時(shí)間和相對峰面積等相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行分析比較，制定優(yōu)化的特征圖譜。

3 結(jié)果

3.1 含量測定結(jié)果

3.1.1 方法學(xué)考察結(jié)果

(1)線性關(guān)系 秦皮乙素的線性方程與回歸系數(shù)分別為：Y=2 265 495.02X-87 370，r=0.999 8，結(jié)果表明秦皮乙素進(jìn)樣量在0.068 28～0.409 68 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

(2)精密度 秦皮乙素的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%，表明儀器精密度良好。

(3)穩(wěn)定性 不同時(shí)間點(diǎn)秦皮乙素含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%，表明本品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

(4)重復(fù)性 不同樣品中秦皮乙素含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.97%，表明本測定方法重復(fù)性良好。

(5)加樣回收率 平均回收率為 99.18%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.48%，表明本方法合理可靠。

3.1.2 樣品中秦皮乙素含量測定

15批紫花地丁藥材因產(chǎn)地不同，秦皮乙素含量有所不同，河南產(chǎn)地秦皮乙素含量普遍偏高，山東臨沂市普遍偏低，安徽亳州市含量差異明顯。各產(chǎn)地紫花地丁秦皮乙素含量見表3，不同產(chǎn)地間秦皮乙素含量的顯著性差異見圖1。

表3 不同產(chǎn)地紫花地丁藥材中秦皮乙素含量

圖1 不同產(chǎn)地間秦皮乙素含量的顯著性差異Fig.1 Significant difference of aesculin content among different habitats

P<0.05表示有顯著性差異；P<0.01表示有極顯著性差異；山西與安徽沒有顯著性差異。

3.2 特征圖譜方法學(xué)考察

3.2.1 精密度

運(yùn)用“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”計(jì)算[5]，結(jié)果相似度均大于0.99，各共有峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明儀器精密度良好(圖2)。

圖2 精密度實(shí)驗(yàn)圖譜匹配結(jié)果Fig.2 Chromatogram matching results of precision test

3.2.2 重復(fù)性

結(jié)果相似度均大于0.97，所得的6個(gè)色譜圖中各共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明該方法的重復(fù)性良好(圖3)。

圖3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)圖譜匹配結(jié)果Fig.3 Chromatogram matching results of repeatability test

3.2.3 穩(wěn)定性

結(jié)果相似度均大于0.96，所得的6個(gè)色譜圖中各共有峰相對保留時(shí)間，相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明供試品溶液在12 h的實(shí)驗(yàn)過程內(nèi)保持穩(wěn)定(圖4)。

圖4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)圖譜匹配結(jié)果Fig.4 Chromatogram matching results of stability test

3.2.4 測定15批次紫花地丁特征圖譜及其相似度評價(jià)

實(shí)驗(yàn)測得15批次紫花地丁藥材特征圖譜，可分離出近6個(gè)色譜峰。與共有模式對照圖譜比較，可以得到6個(gè)共有峰，作為特征圖譜特征峰(圖5、圖6)，并指認(rèn)3個(gè)色譜峰(圖7)。以4號峰為S峰，1～6號共有色譜峰的相對保留時(shí)間分別為：0.42、0.56、0.74、1、1.15、1.33，相對峰面積分別為0.06、0.12、0.17、1、0.04、0.07。圖6為15批次不同產(chǎn)地紫花地丁藥材供試品的特征圖譜，與生成的對照圖譜比較，15批次相似度均大于0.9，表明不同批次間藥材比較穩(wěn)定；相似度見表4。

圖5 紫花地丁藥材對照特征圖譜Fig.5 Controlled characteristic chromatogram of Violae Herba

圖6 15批次不同產(chǎn)地紫花地丁藥材特征圖譜Fig.6 Characteristic chromatogram of 15 batches of Violae Herba from different habitats

a紫花地丁藥材供試品; b東莨菪內(nèi)酯對照品; c秦皮乙素對照品; d木犀草素對照品圖7 對照品特征圖譜Fig.7 Characteristic chromatogram of reference substances

樣品相似度樣品相似度10.98790.99920.986100.98630.987110.99940.997120.99950.999130.99860.999140.99770.999150.99880.999

4 討論

紫花地丁中的秦皮乙素具有多種藥理作用，因此本研究主要針對秦皮乙素成分的測定建立特征圖譜。通過考察15批次不同產(chǎn)地紫花地丁HPLC特征圖譜并運(yùn)用“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[12]，找出6個(gè)共有峰，計(jì)算了各批次紫花地丁藥材特征圖譜的相似度。本研究所建立的方法具有重復(fù)性好、特征性強(qiáng)、方法簡便等特點(diǎn), 能較好地區(qū)分藥材質(zhì)量，可以作為紫花地丁的品質(zhì)鑒別、質(zhì)量控制及資源綜合利用的依據(jù)。