郭賽

（湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃石 435002）

藏雞多生長(zhǎng)在低氣壓（57.7 kPa)、缺氧（氧分壓為11.9 kPa）的惡劣環(huán)境下，因而生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)蛋量較少。27.5%的氧濃度使得低海拔雞品種在高海拔地區(qū)孵化率高達(dá)88.7%[1]，結(jié)合這一特點(diǎn)，我國(guó)引入大量品質(zhì)優(yōu)良、生長(zhǎng)迅速的外國(guó)雞種，與本土藏雞進(jìn)行雜交，培育出易于養(yǎng)殖、生長(zhǎng)周期短的新藏雞品種品系。

研究表明，MyoG基因位于MyoD和Myf5的下游，具有使生肌細(xì)胞向肌小管分化的獨(dú)特功能[2]。MyoG與MRF4具有同源性，是控制肌肉分化且唯一在所有骨骼肌細(xì)胞系中均可表達(dá)的基因，是骨骼肌分化所必需的因子，通過(guò)控制肌細(xì)胞的融合和肌纖維的形成來(lái)對(duì)肌肉的形成起到關(guān)鍵作用[3-5]。本研究探討藏雞的MyoG（肌細(xì)胞生成素）在不同日齡、性別藏雞的胸肌和腿肌的表達(dá)及其與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性，為藏雞在保持原優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上進(jìn)一步培育與改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本次實(shí)驗(yàn)所選取的藏雞來(lái)自于中國(guó)四川省彭州市藏雞養(yǎng)殖基地，挑選采集日齡分別在0、81、119、156、210 d的藏雞共計(jì)150只，按不同的發(fā)育程度分為5組，每組30只，其中15只雄性、15只雌性。

在統(tǒng)一飼養(yǎng)的條件下，藏雞自由飲水采食。屠宰前禁食12 h，通過(guò)放血法進(jìn)行屠宰，快速取其右側(cè)胸肌、腿肌置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

（1）取 60 mg肌肉組織至研缽，加入 500 μL Trizol充分研磨均勻，取 0.1 g放入 RNase free 1.5 mL離心管中。

（2）再次添加 500 μL Trizol，漩渦振蕩，室溫下靜置 10 min。

（3）加入 0.2 mL Trizol的氯仿，用振蕩器劇烈振蕩 15 s，室溫放置 3 min。

（4）4 ℃下，12 000g（14 000 r/min）離心 15 min。離心分層，取上層水相移至另一個(gè) RNase free 1.5 mL離心管中，加 0.5 mL 異丙醇，上下顛倒，靜置 10 min。

（5）4 ℃下，12 000g（14 000 r/min）離心 10 min。

（6）吸去上清液，加入一倍體積的75%乙醇溶液，洗滌沉淀。

（7）4 ℃下，7 500g，離心 5 min。棄去上清液，曬干靜置 10 min。

（8）加入20 μL DEPC處理水，防止RNA降解。

（9）溶于DEPC處理水中，于-70 ℃下冷凍保存。

1.2.2 RNA的定量

（1）每種肌肉組織的RNA樣品各取3份，放入RNase free 1.5 mL 離心管中。

（2）在離心管中加入溶解液，稀釋RNA，并記錄稀釋比例。

（3）以溶解液作空白對(duì)照，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA的濃度，測(cè)量結(jié)果乘以稀釋比例即為樣品濃度。

（4）多次測(cè)量，取其測(cè)量結(jié)果的平均值，得到全部樣品的RNA濃度值，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

（5）用移液槍及RNase free槍頭測(cè)量各個(gè)肌肉組織RNA的體積，并計(jì)算各樣品中加入的RNase-Free Water體積，從而將RNA樣品的濃度全部調(diào)節(jié)一致，調(diào)整為100 ng/μL。定量后RNA樣品濃度的誤差將小于5%。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈

（1）在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下采用RT-PCR技術(shù)合成cDNA。

（2）配制RT-PCR反應(yīng)液，振蕩混勻，瞬時(shí)離心。反應(yīng)液各成分及加入量見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR反應(yīng)混合物組成

（3）PCR 儀反應(yīng)條件設(shè)置為 37 ℃、15 min，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束，在85 ℃、5 s反應(yīng)條件下使反轉(zhuǎn)錄酶失活。

（4）取 0.2 mL PCR 管，依次加入第一鏈 2 μL cDNA、1 μL 上游引物（10 μmoL/L）、1 μL 下游引物（10 μmoL/L）、10 μL PerfectShot Taq 和 6 μL滅菌去離子水。振蕩混勻離心。

（5）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄PCR程序見(jiàn)表2。

表2 反轉(zhuǎn)錄MyoG基因的PCR反應(yīng)程序

1.2.4 熒光定量PCR

（1）置于冰上加入PCR反應(yīng)體系。檢測(cè)內(nèi)參基因和目的基因。

（2）5倍稀釋cDNA溶液，開(kāi)始點(diǎn)樣，然后蓋緊8連管蓋，瞬時(shí)離心。

（3）打開(kāi)樣品槽，將PCR管放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，調(diào)用 PCR 程序：預(yù)變性 95 ℃，30 s，變性 95 ℃，5 s，退火 60 ℃，34 s，45 個(gè)循環(huán)，最后加上溶解程序，然后開(kāi)始運(yùn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用ANOVA程序分析評(píng)估不同肌肉組織、性別間MyoG基因表達(dá)的差異。建立模型，從而分析MyoG基因的表達(dá)與藏雞生長(zhǎng)性狀以及胴體性狀的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用Mean± SEM的形式表示，P＜0.05為存在差異，P＜ 0.01為存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MyoG基因在藏雞不同日齡的表達(dá)情況

藏雞胸肌和腿肌中MyoG基因表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。在胸肌中，隨著日齡的增加，無(wú)論雄性雞和雌性雞MyoG基因表達(dá)水平從開(kāi)始至81日齡急劇下降，隨后一直保持小幅度波動(dòng)，在210日齡達(dá)到較低的水平。

在腿肌中，雄性雞和雌性雞在開(kāi)始到81日齡時(shí)，MyoG基因表達(dá)水平小幅度降低，隨后，雌性雞的基因表達(dá)水平急劇上升，在119日齡達(dá)到峰值。從119～154日齡，基因表達(dá)水平再次急劇下降，從154日齡至210日齡小幅降低。而雄性雞MyoG基因表達(dá)水平自81日齡緩慢上升，在119日齡到154日齡保持恒定，從154日齡至210日齡小幅上升。

119、154、210日齡雄性藏雞MyoG基因在胸肌和腿肌表達(dá)有顯著差異，119日齡時(shí)水平最低（P＜0.05或P＜0.01）；在0，81日齡時(shí)無(wú)顯著差異。

119日齡雌性藏雞MyoG基因在胸肌和腿肌間表達(dá)差異顯著；在0、81、154、210日齡時(shí)無(wú)顯著差異。

相同日齡的雄性和雌性藏雞在胸肌中MyoG基因表達(dá)無(wú)顯著差異。僅119日齡的雄性和雌性藏雞腿肌MyoG基因表達(dá)差異顯著。

圖1 藏雞MyoG基因5個(gè)日齡表達(dá)圖

2.2 MyoG基因表達(dá)與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性

見(jiàn)表3，在雄性雞胸肌中MyoG基因表達(dá)與脛圍存在相關(guān)關(guān)系，與其他性狀無(wú)顯著相關(guān)。在雄性雞胸肌中MyoG基因與各項(xiàng)性狀無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

MyoG基因的表達(dá)與各胴體性狀間的顯著性概率均大于0.05（P＞0.05)，因此，無(wú)論雄性雞雌性雞在胸肌與腿肌中MyoG基因與胴體性狀無(wú)顯著相關(guān)，見(jiàn)表4。

表3 MyoG基因表達(dá)與生長(zhǎng)性狀R的相關(guān)性（P值）

表4 MyoG基因表達(dá)與胴體性狀的相關(guān)性

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的增長(zhǎng)，無(wú)論雄性雞或雌性雞，MyoG基因在胸肌中的表達(dá)量從0日齡時(shí)的最高開(kāi)始急劇減少，且在81、119、154、210日齡這4個(gè)階段保持穩(wěn)定。但在腿肌中，雌性雞MyoG基因表達(dá)量的峰值是在119日齡，而雄性雞MyoG基因表達(dá)量的峰值則是在210日齡，且不同性別之間，MyoG基因在腿肌的表達(dá)情況存在較大差異。據(jù)此可推測(cè)，MyoG基因在胸肌的表達(dá)可能與藏雞性別特異性有關(guān)。

而在探討MyoG基因與經(jīng)濟(jì)性狀裝的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了在雄性雞胸肌中MyoG基因表達(dá)與脛圍存在相關(guān)關(guān)系，與體斜長(zhǎng)、胸骨長(zhǎng)、脛骨長(zhǎng)、盆骨寬等生長(zhǎng)性狀均無(wú)顯著相關(guān)。而雌性雞無(wú)論胸肌或是腿肌中MyoG基因表達(dá)均與生長(zhǎng)性狀無(wú)顯著相關(guān)性。由此可見(jiàn)，MyoG基因與雄性雞生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性大于雌性雞，本研究所選取的研究對(duì)象發(fā)育階段和分析對(duì)象需要我們進(jìn)一步擴(kuò)大樣本。