遲惠榮 張亞惠 曾欣 陳衛(wèi)良 毛碧增

摘要 為鑒定藥用植物內(nèi)生菌的種類，采用稀釋涂布平板法從多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua的根、莖、葉內(nèi)分離出11株內(nèi)生菌菌株，經(jīng)平板對(duì)峙法篩選出對(duì)尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum具有拮抗作用的菌株ZJU-3。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及16S rDNA 序列分析，初步確定該菌株為貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis。通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析，發(fā)現(xiàn)該菌株能產(chǎn)生表面活性素（surfactin）、泛革素（fengycin）和伊枯草菌素（iturin）三類脂肽類化合物。利用鹽酸沉淀和甲醇抽提法獲得了菌株ZJU-3發(fā)酵液中脂肽粗提物。該脂肽粗提物可明顯抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)到 51.6%。經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析表明菌株ZJU-3可產(chǎn)生吲哚乙酸、激動(dòng)素、玉米素、赤霉素等多種植物激素。溫室栽培試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)多花黃精具有顯著的促生效果，根長(zhǎng)和單株根數(shù)明顯高于對(duì)照組。本研究可為進(jìn)一步應(yīng)用該菌株提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 多花黃精; 貝萊斯芽胞桿菌; 內(nèi)生菌; 鑒定; 抗菌活性; 促生

中圖分類號(hào)： S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018337

Hallmann[1]首次完整地將植物內(nèi)生菌（endophyte）定義為能夠在健康植物活組織內(nèi)生存而不引起明顯寄主植物病變的一大類微生物，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌，其中內(nèi)生細(xì)菌主要包括芽胞桿菌屬Bacillus、假單胞桿菌屬Pseudomonas、腸桿菌屬Enterobacter和土壤桿菌屬Agrobacterium等[2]。人們對(duì)植物內(nèi)生菌的研究主要涉及內(nèi)生菌的生物學(xué)作用，如可促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)，促進(jìn)植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[35]、可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)[6]、誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等[67]。

多花黃精為百合科黃精屬植物，被《中國(guó)藥典》（2015年版）收錄[8]，是一味藥食同源的中藥材。肥厚的地下根莖是多花黃精主要的藥用部位， 干燥根莖具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎等功效。多花黃精主產(chǎn)于湖南、安徽、江西、浙江等地，生產(chǎn)上以根莖繁殖為佳，因其藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)保健等功能價(jià)值不斷被人們挖掘，目前黃精原材料處于供不應(yīng)求的狀況。

近年來(lái)，隨著藥用植物的分類、化學(xué)藥理和栽培方式等方面的深入研究，其內(nèi)生菌的多樣性已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。然而，目前僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道黃精內(nèi)生菌的研究，如李艷玲等[9]報(bào)道了泰山黃精的根、莖、葉和果實(shí)中分布最廣的內(nèi)生菌類群——鐮刀菌屬Fusarium sp.，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了研究。汪瀅等[10]報(bào)道，浙江多花黃精內(nèi)生真菌變灰青霉Penicillium canescens可產(chǎn)生3種抗菌物質(zhì)——乙基氧苯氨基亞胺乙酸、灰黃霉素和呋喃-2-甲基-3-羧甲基-4-羥基-5-甲氧基萘，其對(duì)多種植物病原菌具有抑制活性。柏曉輝等[11]從黃山地區(qū)健康的野生黃精根莖中分離得到1株內(nèi)生菌 HJ-1，該菌對(duì)綠膿桿菌P.aeruginosa、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhi和蘇云金芽胞桿菌B.thuringiensis均具有顯著抑菌效果。

本論文主要針對(duì)浙江省江山市的多花黃精的內(nèi)生細(xì)菌展開(kāi)研究，從中分離篩選到一株對(duì)尖孢鐮刀菌F.oxysporum具有拮抗作用的菌株。在此基礎(chǔ)上，開(kāi)展了該菌株的生理生化和分子鑒定;對(duì)其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)成分和植物激素種類進(jìn)行了分析，并測(cè)定了對(duì)尖孢鐮刀菌的抗菌作用和對(duì)植物的促生作用。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株：多花黃精采自浙江省江山市（28°22′26.97″N，118°30′36.14″E），由浙江省江山市保安鄉(xiāng)黃精種植基地提供。

供試菌株：多花黃精病原菌尖孢鐮刀菌F.oxysporum保存于浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所。

培養(yǎng)基與試劑：LB、PDA和PDB培養(yǎng)基參照《植病研究方法》[12]配制，分別用于細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)。細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司;PCR引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成;Taq酶、dNTPs等試劑購(gòu)于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器設(shè)備：Bio-Rad T100型PCR儀;Fire Read 型凝膠成像儀;熱電LYNX6000型高速冷凍離心機(jī);Agilent 1100 高效液相色譜儀和Agilent 6410三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀;基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）;日立HITACHI-TM100臺(tái)式掃描電鏡;HITACHI-7650透射電鏡;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE301）。

1.2 內(nèi)生菌株的分離與拮抗作用測(cè)定

1.2.1 內(nèi)生菌株的分離

采集的多花黃精樣品用自來(lái)水沖洗10 min，自然晾干，然后依次用 75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3次，5% NaClO 浸泡6 min，無(wú)菌水沖洗5次。樣品經(jīng)表面消毒后，將根、莖、葉用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)，莖切成 1 cm 左右的小段，置于 LB 培養(yǎng)基平板和PDA平板上;另取將根、葉加無(wú)菌水研磨至糊狀，靜置 10 min，用無(wú)菌水按梯度102～106稀釋，取20 μL分別涂布于 LB 平板和PDA平板，同時(shí)取表面消毒時(shí)最后1次的洗滌水20 μL涂布于LB 平板和PDA平板上，作為對(duì)照組以驗(yàn)證消毒是否徹底。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，置于28℃下培養(yǎng)48 h。選取不同形態(tài)特征的單菌落反復(fù)平板劃線純化后，將不同菌株菌懸液與20%甘油按照1∶1比例混合，保存于-70℃。

1.2.2 內(nèi)生菌株拮抗作用測(cè)定

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選對(duì)尖孢鐮刀菌F.oxysporum具有抑制作用的菌株。首先將尖孢鐮刀菌在PDA平板上于 28℃培養(yǎng)5 d，用直徑為5 mm的打孔器在平板上打取圓形病原菌菌餅，將其接入新的PDA平板中央，然后在病原菌菌餅兩側(cè)等距離（2.5 cm）處點(diǎn)接分離得到的細(xì)菌菌株，于 28℃培養(yǎng) 3 d 后觀察記錄抑菌圈。每個(gè)處理重復(fù)3 次，有抑菌圈的菌株即為拮抗菌。

1.3 內(nèi)生拮抗菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

將分離菌株劃線接種于LB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng) 24 h 后觀察菌落形態(tài)特征。進(jìn)行革蘭氏染色，并利用掃描電鏡、透射電鏡觀察菌體、芽胞形態(tài)及大小。

1.3.2 生理生化特征分析

將分離菌株劃線接種于LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 24～48 h 后依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]對(duì)該菌株的生理生化特征進(jìn)行鑒定。

1.3.3 拮抗菌的16S rDNA序列測(cè)定、gyrB基因序列測(cè)定及同源性分析

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取拮抗菌株全基因組DNA。采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492R：5′-TAC GGC TAC TTG TTA CGA CTT-3′，以1.2.2篩選到的拮抗菌（ZJU-3）基因組為模板進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增。PCR運(yùn)行程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。選用引物UP1和UP2r[14] 進(jìn)行g(shù)yrB基因擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃ 4 min;98℃變性10 s，62℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán);72℃10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到特異性片段，將樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將所測(cè)得序列登錄在NCBI網(wǎng)站，與GenBank中的所有細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性98%以上的序列，再結(jié)合其模式菌株序列，利用MEGA 5.0用鄰接法（neighbor-joining，N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行同源性分析鑒定。

1.4 菌株ZJU-3脂肽類化合物分析與抗菌檢測(cè)

1.4.1 MALDI-TOF-MS檢測(cè)與分析

將活化后的菌株ZJU-3按1%接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)12 h。然后以無(wú)菌水稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取2個(gè)單菌落于目標(biāo)板孔靶上，與1 μL輔助基質(zhì)混勻，自然風(fēng)干后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）檢測(cè)[15]。儀器參數(shù)為： 反射操作模式，正離子檢測(cè)，檢測(cè)范圍100～2 000 Da，激光點(diǎn)擊數(shù)每圖譜50，激光頻率30.0 Hz，離子源加速電壓 20 kV，反射電壓23.5 kV 脈沖離子。

1.4.2 脂肽粗提物的制備

菌株ZJU-3培養(yǎng)：采用LB培養(yǎng)基，100 mL/250 mL三角瓶裝量，28℃、180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心20 min，取上清液用孔徑為0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，獲得無(wú)菌發(fā)酵液。采取鹽酸沉淀和甲醇抽提法從無(wú)菌發(fā)酵液中獲得脂肽粗提物[16]。

1.4.3 脂肽粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定脂肽粗提物的生物活性。用甲醇將得到脂肽粗提液依次稀釋為440、 220、110、55 μg/mL，加入到融化的PDA培養(yǎng)基中制成脂肽平板，以加等體積甲醇的PDA平板為對(duì)照，在平板中央接種直徑為5 mm的尖孢鐮刀菌菌塊，每個(gè)處理重復(fù)3次，28℃ 培養(yǎng)4 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率[17]。相對(duì)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-脂肽粗提物處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑]× 100%。

1.5 菌株ZJU-3對(duì)多花黃精的促生作用

1.5.1 菌株ZJU-3發(fā)酵液中激素種類分析

將菌株ZJU-3接種至固體LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基內(nèi)， 37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，制成種子液。取種子發(fā)酵液按照1%接種量接種100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，之后用乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，于4℃保存，用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）測(cè)定吲哚乙酸（IAA）、激動(dòng)素（kinetin）、赤霉素（GA3）和玉米素（zeatin）的含量[18]。質(zhì)譜條件如下：采用電噴霧負(fù)/正離子模式，毛細(xì)管電壓3.0 kV，霧化氣壓力0.31 MPa，干燥氣體（N2）流速5 L/min，干燥氣體溫度325℃，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速11 L/min。采用MRM 模式進(jìn)行檢測(cè)，收集LC-MS如下數(shù)據(jù)：樣品名稱，保留時(shí)間，碰撞解離電壓，母離子（m/z），子離子（m/z），碰撞能量和掃描模式。

1.5.2 盆栽促生試驗(yàn)

將3年生多花黃精塊莖用0.5%次氯酸鈉表面消毒15 min，無(wú)菌水漂洗3～4次，播種于基質(zhì)（草炭∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1）中。設(shè)置3個(gè)處理。A：LB液體培養(yǎng)基灌根;B：1×108cfu/mL拮抗菌液灌根;C：1×107cfu/mL抗菌液灌根。每處理3盆，3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)條件：25℃，L∥D=16 h∥8 h，觀察多花黃精的生長(zhǎng)情況，兩個(gè)月后記錄各個(gè)生物量的變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用最小顯著差數(shù)（LSD）法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離及拮抗菌鑒定

從根、莖、葉中共分離出11株內(nèi)生菌，分別記作ZJU-1～ZJU-11（表1），采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法獲得對(duì)尖孢鐮刀菌F.oxysporum有較強(qiáng)抑制作用的菌株ZJU-3（圖1），對(duì)尖孢鐮刀菌菌落邊緣的菌絲進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)處理組的菌絲明顯變粗，菌絲出現(xiàn)斷裂、消融現(xiàn)象，表面出現(xiàn)褶皺，表明該菌株對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的抑制作用。

2.2 菌株ZJU-3的鑒定

2.2.1 菌株ZJU-3的菌落形態(tài)和生理生化特性

ZJU-3在LB培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)24 h后，菌落類似圓形，邊緣不規(guī)則，皺褶狀凸起，表面粗糙不透明，干燥，菌落呈淺黃色（圖2a）。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，菌體呈桿狀，大小為（0.5～0.7）μm×（1～3）μm（圖2b），芽胞橢圓，中生或端生，長(zhǎng)為0.6～1 μm（圖2c～d）。菌株ZJU-3的硫化氫、接觸酶等多項(xiàng)生理生化特征的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 菌株ZJU-3的分子生物學(xué)鑒定

菌株ZJU-3經(jīng)16S rDNA PCR擴(kuò)增后，得到1條1 400 bp左右的條帶，膠回收測(cè)序后獲得長(zhǎng)度為1 425 bp 的DNA序列，將該序列在NCBI上注冊(cè)，獲得序列登錄號(hào)MH298776。將菌株ZJU-3的16S rDNA序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，ZJU-3與B.velezensis CR-502（GenBank登錄號(hào)：AY603658）、B.siamensis KCTC 13613（GenBank登錄號(hào)： AJVF01000043）、B.amyloliquefaciens DSM 7（GenBank登錄號(hào)：FN597644）的同源性分別為99.85%、99.72% 和99.58%。通過(guò)MEGA 5.0構(gòu)建該菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，顯示該菌株與這3個(gè)菌株在一個(gè)分支上，無(wú)法確定其分類地位。

菌株ZJU-3經(jīng)gyrB基因序列的PCR擴(kuò)增后，得到1條1 147 bp的條帶，該序列與GenBank中B.velezensis strain KACC 13105（GenBank登錄號(hào)：NZ_JTKJ02000014.1）、B.siamensis strain XY18（GenBank登錄號(hào)：LAGT01000009.1）、 B.amyloliquefaciens DSM7（GenBank登錄號(hào)：FN597644）同源性為99%，通過(guò) MEGA 5.0構(gòu)建該菌株的gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示該菌株與B.velezensis strain KACC 13105在一個(gè)分支上。參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，根據(jù)枯草芽胞桿菌B.subtilis和解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens不能產(chǎn)生卵磷脂酶，排除枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌的可能性。結(jié)合形態(tài)學(xué)及其他生理生化特征，將菌株ZJU-3鑒定為貝萊斯芽胞桿菌（于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)：CCTCC No： M 2018311）。

2.3 菌株ZJU-3脂肽類化合物分析

2.3.1 MALDI-TOF-MS檢測(cè)與分析

圖5a為貝萊斯芽胞桿菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)所得的脂肽類次生代謝物的質(zhì)譜圖（m/z 700～1 500），結(jié)果顯示：表面活性素和伊枯草菌素的分子離子峰集中于m/z 1 000～1 100（圖5b）;泛革素位于m/z 1 400～1 500（圖5c）。菌株ZJU-3在m/z值為1 053.6、1 069.6、1 066.7、1 083.7、1 081.6、1 097.7、1 095.7、1 111.7、1 099.7（圖5b）處有離子峰，這9個(gè)離子峰對(duì)應(yīng)于桿菌霉素的質(zhì)量;在m/z值為1 066.7、1 082.7、1 080.7、1 094.7、1 098.7（圖5b）處有離子峰，這5個(gè)峰對(duì)應(yīng)于伊枯草菌素的質(zhì)量;在m/z值為1 044.7、1 059.7、1 058.7、1 074.7（圖5b）處有離子峰，這4個(gè)峰對(duì)應(yīng)于表面活性素的質(zhì)量。在m/z值為1 435.0、1 450.0、1 464.0、1 478.0、1 492.0、1 506.0（圖5c）處有離子峰，這6個(gè)峰對(duì)應(yīng)于泛革素的質(zhì)量。

2.3.2 脂肽粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

采用酸沉淀和甲醇抽提法從ZJU-3發(fā)酵液中提取脂肽物質(zhì)，進(jìn)行冷凍干燥后確定該脂肽粗提物的得率為20 mg/mL。尖孢鐮刀菌菌塊在含不同濃度脂肽粗提物的PDA培養(yǎng)基上23℃培養(yǎng)4 d后，與對(duì)照相比，供試濃度下ZJU-3脂肽物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲擴(kuò)展均表現(xiàn)出抑制作用，而且隨著脂肽濃度的增加，其抑制作用增強(qiáng)，440 μg/mL時(shí)抑制率為51.6%（圖6e）。

2.4 菌株ZJU-3對(duì)多花黃精的促生作用

2.4.1 菌株ZJU-3發(fā)酵液中的吲哚乙酸、激動(dòng)素、赤霉素和玉米素含量測(cè)定

通過(guò)LC-MS分析，定量測(cè)定菌株ZJU-3中吲哚乙酸（IAA）、激動(dòng)素（kinetin）、赤霉素（GA3）和玉米素（zeatin）的含量。在同樣的色譜條件下，赤霉素標(biāo)樣在3.28 min有一個(gè)色譜峰（如圖7a1），發(fā)酵液在保留時(shí)間3.88 min有一個(gè)色譜峰（如圖7a2），它們的保留時(shí)間基本一致，可以確定發(fā)酵液中產(chǎn)生了赤霉素，進(jìn)一步計(jì)算得到赤霉素的含量為0.07 ng/mL。

在同樣的色譜條件下，標(biāo)樣激動(dòng)素在保留時(shí)間2.48 min有一個(gè)色譜峰（如圖7b1），發(fā)酵液在保留時(shí)間2.48 min有一個(gè)色譜峰（如圖7b2），它們的保留時(shí)間一致，可以確定發(fā)酵液中產(chǎn)生了激動(dòng)素，進(jìn)一步計(jì)算得到激動(dòng)素的含量為21.34 ng/mL。

在同樣的色譜條件下，標(biāo)樣玉米素在保留時(shí)間1.59 min有一個(gè)色譜峰（如圖7c1），發(fā)酵液在保留時(shí)間1.74 min有一個(gè)色譜峰（如圖7c2），保留時(shí)間基本一致，可以確定發(fā)酵液中產(chǎn)生了玉米素，經(jīng)過(guò)計(jì)算，玉米素含量為0.02 ng/mL。

在同樣的色譜條件下，標(biāo)樣吲哚乙酸在保留時(shí)間5.94 min有一個(gè)色譜峰（如圖7d1），發(fā)酵液在保留時(shí)間5.48 min有一個(gè)色譜峰（如圖7d2），它們的保留時(shí)間基本一致，可以確定發(fā)酵液中產(chǎn)生了吲哚乙酸，進(jìn)一步計(jì)算得到吲哚乙酸的含量為8.29 ng/mL。

2.4.2 盆栽促生試驗(yàn)

多花黃精各項(xiàng)生物量如圖8所示，菌液處理后，多花黃精芽長(zhǎng)差異不明顯，但根長(zhǎng)、單株根數(shù)和芽數(shù)差異明顯，菌液處理后，根長(zhǎng)、根數(shù)都明顯增加，1×108 cfu/mL處理組的多花黃精部分根長(zhǎng)、單株根數(shù)相比于對(duì)照組增長(zhǎng)了44.6%、102.4%，1×107 cfu/mL處理組的多花黃精部分根長(zhǎng)、單株根數(shù)相比于對(duì)照組增長(zhǎng)了20.7%、64.5%，而處理組根莖上的芽長(zhǎng)明顯小于對(duì)照組，表明菌株ZJU-3對(duì)多花黃精地下部分有更明顯的促生長(zhǎng)作用，據(jù)此猜想與菌體自身產(chǎn)生的內(nèi)源激素有著密切的聯(lián)系。

3 討論

1993 年美國(guó)學(xué)者Stierle等[22]從短葉紅豆杉Taxus brevifolia中分離到內(nèi)生真菌，其可以產(chǎn)生抗癌藥物紫杉醇，這一發(fā)現(xiàn)掀起了從藥用植物中分離內(nèi)生菌的熱潮。人們逐漸開(kāi)始研究具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用植物與自身內(nèi)生菌的關(guān)聯(lián)。國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究表明，內(nèi)生菌對(duì)藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育有著巨大影響，植物內(nèi)生菌自身能夠產(chǎn)生次生代謝物，對(duì)病蟲害產(chǎn)生一定程度的抵抗力[23]。Wen等[24]在藥用植物樟腦中發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌B.subtilis EBS05對(duì)小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis的防治效果高達(dá)91.2%，并在該拮抗菌株所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)中分離得到surfactin A，并研究了該物質(zhì)對(duì)根莖生長(zhǎng)的作用。鄧建良等[25]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌YN-1發(fā)酵液對(duì)棉花枯萎病有抑制作用，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中含有C14-Iturin A～C16-Iturin A、C14-Fengycin A～C17-Fengycin A、C16-Fengycin B和C17-Fengycin B 9種脂肽類抗生素。本試驗(yàn)采用提取效率更高的酸沉淀法，研究發(fā)現(xiàn)B.velezensis ZJU-3能夠產(chǎn)生表面活性素、桿菌霉素、伊枯草菌素、泛革素等多種脂肽類化合物，且440 μg/mL濃度的脂肽粗提液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到51.6%，可抑制病原真菌菌絲生長(zhǎng)發(fā)育，或許在一定程度上破壞了膜結(jié)構(gòu)，后期將針對(duì)脂肽粗提液對(duì)孢子的影響展開(kāi)研究。

同時(shí)，研究表明，固氮螺菌屬Azospirillum、假單胞菌屬Pseudomonas、芽胞桿菌屬Bacillus、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium以及根瘤菌屬Rhizobium等多種內(nèi)生菌可產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素吲哚乙酸[2]，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。Lu等[26]發(fā)現(xiàn)黃花蒿內(nèi)生菌在體外培養(yǎng)時(shí)，能產(chǎn)生對(duì)小麥和黃瓜幼苗生長(zhǎng)具有抑制或促進(jìn)作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)該菌能產(chǎn)生吲哚乙酸。在本研究中發(fā)現(xiàn)B.velezensis ZJU-3產(chǎn)生多種植物內(nèi)源激素如吲哚乙酸、激動(dòng)素、玉米素，用菌株發(fā)酵液對(duì)多花黃精植株進(jìn)行定期澆灌，發(fā)現(xiàn)植株的側(cè)根明顯增多，根長(zhǎng)相比對(duì)照組明顯增加，植株?duì)I養(yǎng)代謝加快。

已有資料表明，在內(nèi)生菌與植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，內(nèi)生菌可能因與植物之間發(fā)生基因橫向轉(zhuǎn)移或受植物內(nèi)生環(huán)境的影響，具有產(chǎn)生與藥用植物相似結(jié)構(gòu)或相似功效的天然產(chǎn)物、甚至新結(jié)構(gòu)或新活性的天然活性產(chǎn)物的潛力[27]。我國(guó)學(xué)者已從蛇足石杉Huperzia serrata和柳杉葉馬尾杉Phlegmariurus cryptomerianus中分離到6種以上的產(chǎn)石杉?jí)A甲的內(nèi)生真菌，其中一株編號(hào)為 Slf14 的 Shiraia 屬菌株石杉?jí)A甲產(chǎn)量較高，達(dá)到了327.8 μg/L[28]。分離自黃花蒿的青霉屬Penicillium內(nèi)生真菌能有效促進(jìn)黃花蒿組培苗生長(zhǎng)及青蒿素合成[29]。但對(duì)于多花黃精來(lái)說(shuō)，內(nèi)生菌與藥用黃精成分的相關(guān)性還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究獲得的多花黃精內(nèi)生貝萊斯芽胞桿菌菌株ZJU-3不但產(chǎn)生多種抗菌的脂肽類化合物，同時(shí)產(chǎn)生多種植物內(nèi)源激素，對(duì)多花黃精具有良好的促生長(zhǎng)效果，尤其促進(jìn)植株生根，以上研究為未來(lái)該菌株的綜合開(kāi)發(fā)利用及研制生防藥劑提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）