張璐 劉奇志 張國珍

摘要 由葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的梨輪紋病是梨生產中重要的真菌性病害，主要造成樹勢早衰和果實腐爛，嚴重影響梨的產量和品質。本研究選取市售的6個品種的梨果實，用分離自梨枝干的輪紋病菌進行了離體果實接種，測定不同品種果實對梨輪紋病的抗性差異。接種后6 d，按照病斑直徑從大到小的順序，品種排序依次為‘豐水梨>‘南果梨>‘庫爾勒香梨>‘皇冠梨>‘雪花梨>‘碭山酥梨，隨病斑減小抗性依次增強。測定了4種殺菌劑對梨輪紋病菌菌絲生長的抑制作用，結果表明，咯菌腈、氟啶胺和咪鮮胺對梨輪紋病菌的菌絲生長有很強的抑制作用，EC50分別為0.010 3、0.022 4 μg/mL和0.034 3 μg/mL;代森錳鋅的EC50為3.860 7 μg/mL，也有較好的抑菌效果。本試驗結果為了解不同梨品種對輪紋病的抗性及殺菌劑的選用提供了依據(jù)，具有一定的指導意義。

關鍵詞 梨輪紋病; 品種抗性; 殺菌劑

中圖分類號： S 436.612.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018368

葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea是引起農林業(yè)重要真菌病害的病原菌，在生態(tài)系統(tǒng)中占有重要的地位[1]。B.dothidea屬子囊菌門，葡萄座腔菌屬[2]。我國最早于1928年在遼寧省發(fā)現(xiàn)該病原菌引起蘋果輪紋病[3]。B.dothidea寄主廣泛，可侵染梨、蘋果、桃、李、杏、海棠、板栗、棗等至少45個屬的植物，導致木材品質下降，花朵觀賞價值降低，水果質量變差[47]。

我國是梨生產大國，梨種類繁多，栽培面積僅次于蘋果，梨果生產在我國占有重要的經濟地位[8]。由B.dothidea引起的梨輪紋病是造成梨減產的重要病害。梨樹樹干、葉片、果實等部位均可被侵染，導致樹勢早衰、葉片干枯脫落、果實腐爛，尤其是貯藏期或多雨的年份，病害發(fā)生嚴重時爛果率超過80%，造成無法挽回的損失[9]。近年來，梨輪紋病不僅在中國發(fā)生嚴重，在日本、韓國等周邊國家的發(fā)病率也逐年升高[10]。因此，有必要加強對梨輪紋病的相關研究。

利用抗病品種是防治植物病害的有效途徑之一。不同梨品種枝干或果實對輪紋病的抗性存在差異。如山東地區(qū)種質資源中‘金秋、‘毛杜梨和‘秋白梨較抗枝干輪紋病[11]。田路明等[12]采用幼果期無傷接種，比較了13份梨品種在果實成熟期和室溫貯藏期的輪紋病發(fā)生情況，表明不同品種果實對輪紋病抗性不同，室溫貯藏期的果實發(fā)病率較成熟期顯著提高。江蘇省的14個品種中，‘金水秋、‘晚三吉和‘碭山梨對果實輪紋病表現(xiàn)為抗病[9]。由此可見，基于自然發(fā)病條件下對梨品種果實抗輪紋病的測定易受環(huán)境條件的影響，在有利于果實輪紋病發(fā)生的時期接種，測定果實對輪紋病的抗性能更好地反映品種間的抗性。

本研究分別從白梨系統(tǒng)、砂梨系統(tǒng)和秋子梨系統(tǒng)中選取不同代表品種，在實驗室相對一致的可控條件下，測定了6種梨果對輪紋病的抗性差異，避免了田間環(huán)境多變對試驗結果的影響。同時，試驗還測定了4種殺菌劑對輪紋病菌的抑菌作用。旨在為充分利用不同梨品種果實對輪紋病的抗性以及為梨生產上選用有效的殺菌劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

輪紋病菌分離自2016年從北京市海淀區(qū)采集的表現(xiàn)典型輪紋病癥狀的梨樹樹干。

梨果實品種：白梨系統(tǒng)‘庫爾勒香梨、‘碭山酥梨和‘雪花梨;砂梨系統(tǒng)‘皇冠梨和‘豐水梨;秋子梨系統(tǒng)‘南果梨。梨果實均購自北京市海淀區(qū)的超市。

供試殺菌劑原藥：90%代森錳鋅、95.2%咯菌腈、97%氟啶胺和98.1%咪鮮胺，由中國農業(yè)大學種子病理學實驗室劉西莉教授提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離和純化

采用常規(guī)組織分離法對表現(xiàn)有瘤狀凸起病斑的梨輪紋病樹皮病樣進行分離。在病健交界處取約5 mm見方的組織塊，在3.3% NaClO溶液中表面消毒1 min，用無菌蒸餾水漂洗3次，再用滅菌吸水紙吸干表面水分，置于PDA培養(yǎng)基上，25℃，光照培養(yǎng)。3 d后從病組織塊周圍長出的菌落邊緣挑取少量菌絲轉皿培養(yǎng)，待病原菌產孢后，配制孢子懸浮液，采用單孢分離法獲得純化的單孢菌株。對菌株進行編號保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌株的形態(tài)學觀察

將純化的菌株B-8-1接種于PDA平板上，25℃，光照培養(yǎng)15 d，觀察菌落的顏色、形態(tài)、質地以及氣生菌絲的生長情況，是否產生分生孢子等。

1.2.3 分離菌株的分子生物學鑒定

DNA提?。簩⒕闎-8-1接種于鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板，25℃，光照培養(yǎng)5 d，刮取菌落表面適量菌絲，采用CTAB法提取基因組DNA。

PCR擴增及序列分析：用3對引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3′）、Bt-2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）/Bt-2b（5′-AC-CCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）和EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）/EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）分別對菌株B-8-1的rDNA-ITS、β-tubulin基因和EF1-α基因進行PCR擴增[13]。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序。測序結果在GenBank中進行BLAST比對分析。

1.2.4 梨果實接種

采用室內離體接種法測定不同梨品種的果實對梨輪紋病的抗性差異。將菌株B-8-1于PDA平板上進行活化，25℃，光照培養(yǎng)5 d，在菌落邊緣打取直徑2 mm的菌塊用于接種。

選購市售的無傷、健康的6種梨果實，用75%乙醇表面消毒，無菌水沖洗3次，自然晾干，在每個果實的赤道部打1個直徑2 mm的小孔，接種梨輪紋病菌菌絲塊，以接種PDA培養(yǎng)基塊的處理為對照。每個處理接種10個果實。25℃，黑暗放置48 h后，在L∥D=12 h∥12 h光照黑暗交替條件下培養(yǎng)6 d，每24 h觀察1次發(fā)病進程，6 d后測量病斑直徑。計算各品種梨果實病斑直徑平均值，評價各品種的抗性。

1.2.5 殺菌劑的毒力測定

采用菌絲生長抑制法測定殺菌劑對輪紋病菌菌株B-8-1的抑制作用。

用分析天平準確稱量殺菌劑原藥分別放入5 mL保存管中，加入一定體積的二甲基亞砜（DMSO），在QL-901振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）上振蕩至藥劑充分溶解，配制成105 mg/L的母液，4℃黑暗保存?zhèn)溆谩?/p>

為確保所設置每種藥劑的濃度對輪紋病菌的抑制率處于5%～95%之間，90%代森錳鋅設置7個濃度梯度，分別為0.1、1.0、5.0、25.0、50.0、75.0 mg/L和100.0 mg/L;95.2%咯菌腈設置6個濃度梯度，分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05 mg/L和0.1 mg/L;97%氟啶胺設置7個濃度梯度，分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L和1.0 mg/L;98.1%咪鮮胺設置7個濃度梯度，分別為0.000 5、0.002、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L和1.0 mg/L。

將藥液加入60℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中，制成系列濃度的含藥平板，以加入DMSO的培養(yǎng)基作為對照。在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，接種到含藥平板中央，每處理3次重復。25℃，黑暗培養(yǎng)。待對照菌落直徑長至約60 mm時，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%;

數(shù)據(jù)處理：使用DPS 7.05數(shù)據(jù)分析軟件，將菌絲生長抑制率換算成幾率值（y），藥劑濃度換算成濃度對數(shù)（x），求得濃度對數(shù)與幾率值的線性回歸方程y=ax+b，并計算出藥劑對梨輪紋病菌的抑制中濃度（EC50）、幾率值和相關系數(shù)r。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學鑒定

菌株B-8-1在PDA培養(yǎng)基上25℃下培養(yǎng)，呈圓形輻射狀生長。菌絲體初期白色，隨著培養(yǎng)時間的延長，氣生菌絲呈灰黑色，20 d左右菌落完全變?yōu)榘岛谏▓D1a和b）。在梨果實上產生黑色扁球形的分生孢子器（圖1c），從分生孢子器中釋放出無色、單胞、紡錘形或橢圓形、大小（24～30）μm×（6～8）μm的分生孢子（圖1d）。根據(jù)菌落形態(tài)和顏色、分生孢子顏色、大小、形狀等形態(tài)特征[1]，可將菌株B-8-1鑒定為葡萄座腔菌屬Botryosphaeria。

2.2 分離菌株的分子生物學鑒定

用3對引物ITS1/ITS4、Bt-2a/Bt-2b、EF1-728F/EF1-986R對菌株B-8-1的基因組DNA進行PCR擴增，分別得到大小約為550、500和250 bp的條帶。擴增產物經測序后在NCBI上進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)菌株B-8-1的ITS序列與B.dothidea（登錄號為MG595271.1、KF516940.1、KC960911.1、JF800138.1、JF800137.1、GQ870286.1等）的相似性均為99%;β-tubulin基因的序列與B.dothidea（登錄號為KU565871.1、KR260833.1、KC961011.1、JF441078.1、HQ660476.1、KX281147.1等）的相似性為100%;EF1-α基因的序列與B.dothidea（登錄號為KC961067.1、KC961053.1、KC961047.1、KC961041.1、JQ900341.1、GU251233.1等）的相似性為100%。序列分析表明，菌株B-8-1為葡萄座腔菌B.dothidea。

2.3 不同品種梨果實對輪紋病的抗性

用梨輪紋病菌菌株B-8-1接種健康梨果實引起果實腐爛發(fā)病。果實表皮組織最初變軟，然后以接種點為中心向外擴展，病斑近圓形，水漬狀，最后變?yōu)闇\褐色、褐色或黑褐色大病斑;‘皇冠梨和‘雪花梨還伴有深淺相間的褐色同心輪紋（圖2a～f）。病部果肉腐爛伴有酸臭味。

從病斑大小看，不同品種果實對輪紋病的抗性存在明顯差異?！S水梨病斑直徑最大，為49.7 mm，相對最為感病;其次為‘南果梨和‘庫爾勒香梨，病斑直徑分別為40.0 mm和36.1 mm;‘皇冠梨和‘雪花梨病斑直徑較小，分別為25.9 mm和24.4 mm;‘碭山酥梨病斑直徑最小，為15.1 mm，在所測試的6個品種中表現(xiàn)最為抗病。同一梨系統(tǒng)的不同品種對輪紋病的抗性也不相同，如砂梨系統(tǒng)的‘皇冠梨和‘豐水梨、白梨系統(tǒng)的‘庫爾勒香梨和‘碭山酥梨品種間的病斑大小有顯著差異，對輪紋病的抗性明顯不同（表1）。對照梨果均未發(fā)病，接種點表現(xiàn)為失水干縮或失水變褐（圖2a1～f1）。

2.4 殺菌劑對梨輪紋病菌的毒力測定

室內毒力測定結果表明，供試4種殺菌劑代森錳鋅、咯菌腈、氟啶胺和咪鮮胺對梨輪紋病菌菌絲生長均具有較好的抑制作用。根據(jù)EC50，咯菌腈、氟啶胺和咪鮮胺對梨輪紋病菌菌株B-8-1菌絲生長的抑制作用很強，代森錳鋅的抑制作用相對較弱，按照由強到弱依次為：咯菌腈>氟啶胺>咪鮮胺>代森錳鋅。4種殺菌劑的毒力回歸方程、相關系數(shù)、EC50結果列于表2。

3 討論

梨輪紋病菌是一種弱寄生菌[14]。明確梨果品種間抗性，有利于對輪紋病的防控和梨果增產保質，提高經濟效益。李樹玲和黃禮森[15]對秋子梨、白梨和洋梨3個梨系統(tǒng)果實輪紋病在田間的自然發(fā)生情況進行了調查，發(fā)現(xiàn)秋子梨系統(tǒng)的果實大部分抗病，‘南果梨最抗病;白梨和洋梨系統(tǒng)的果實大部分不抗病。曹玉芬等[16]采用噴霧接種法對梨樹上的幼果進行接種，在成熟期鑒定了28個梨品種果實對輪紋病的抗性，其中白梨系統(tǒng)最抗病，8個品種中有5個表現(xiàn)高抗或抗病;砂梨為中間類型，西洋梨最差。本試驗結果發(fā)現(xiàn)不同梨系統(tǒng)果實對輪紋病的抗性有明顯差異，其中白梨系統(tǒng)的‘碭山酥梨抗性最強，砂梨系統(tǒng)的‘豐水梨抗性最差，秋子梨系統(tǒng)的‘南果梨不抗輪紋病。本試驗結果與前人調查結果[1516]有出入，其原因可能與測定方法不同有很大關系。本試驗采用的是室內離體接種法，接種后溫濕度控制在一致的條件下，避免了外在環(huán)境因素多變而造成的影響。

有研究表明，梨品種的抗性差異可能與梨品種的成熟期早晚[9]、糖酸含量[17]等因素有關。趙梅等[18]發(fā)現(xiàn)果肉中石細胞和酚類物質的含量與梨果對輪紋病的抗擴展能力呈正相關。梨品種所表現(xiàn)出的抗病性，除自身組織結構外，是否存在相關抗性基因，是否與相關基因表達的產物有關[7]，還需更深入的研究來進一步證明。

傳統(tǒng)上多用波爾多液、石硫合劑等無機殺菌劑防治梨輪紋病，后來出現(xiàn)了多菌靈、甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑。但近些年隨著病原菌抗藥性的產生，很多藥劑的藥效逐年降低[7， 19]。有結果表明，25%吡唑醚菌酯乳油和80%戊唑醇可濕性粉劑均為防治梨輪紋病較為理想的低毒、低殘留、持效期長的內吸治療性殺菌劑，田間噴灑時不僅可殺死植株表面的病原菌，還可被植株迅速吸收傳導至體內發(fā)揮作用[2022]。本試驗測定了有機硫類的代森錳鋅、二硝基苯胺類的氟啶胺、吡咯類的咯菌腈和酰胺類的咪鮮胺4種殺菌劑對輪紋病菌菌絲生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)氟啶胺、咪鮮胺和咯菌腈均有很好的抑菌作用。試驗結果為梨輪紋病的化學防治提供了候選藥劑，也為藥劑的輪換使用提供了科學依據(jù)。

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（責任編輯：楊明麗）