正造和反季節(jié)龍眼花芽分化過程中內(nèi)源激素水平的變化

楊子琴 黃旭明 陳業(yè)淵

摘要 研究了正造及反季節(jié)龍眼樹體葉片及頂芽中內(nèi)源激素IAA、GA、ABA、iPA、ZR在花芽分化過程中的變化。結(jié)果表明，花芽分化過程中葉片及頂芽ABA含量最高，IAA次之，ZR、iPA及GA含量極低。氯酸鉀處理可導(dǎo)致葉片及頂芽iPA含量迅速升高；葉片GA含量遠(yuǎn)高于頂芽，而ABA以頂芽中富集量最大；ZR以頂芽含量較高；雖然IAA在葉片和頂芽都有較高水平，但變化幅度不大。綜合各激素變化情況認(rèn)為，花芽分化過程中iPA、GA、ABA含量變化幅度最大，且ABA在花芽分化的發(fā)生部位頂芽富集說明ABA在龍眼花芽分化過程中起更重要的作用。

關(guān)鍵詞 龍眼；內(nèi)源激素；花芽分化

中圖分類號(hào) S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）09-0047-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.015

Abstract The endogenous hormone levels of IAA， GA， ABA， iPA， ZR and their changes were investigated in leaves and buds of six longan （Dimocarpus longan Lour.） trees for onseason and offseason flowering development after winter shoot mature. The result showed that the hormones contents of different types were different in vegetative organs， presented a decreasing tendency from ABA to IAA and ZR to iPA and GA. Potassium chlorate treatment could cause iPA content rapidly increase in leaves and buds. GA content in leaves were significantly higher than those of the buds， but the largest ABA content was found in the bud. And high levels of ZR were in the buds. Although IAA had a higher level in leaves and buds， the change magnitude was small. The hormone changes had concluded that， iPA， GA， ABA content changed greatly in the flower bud differentiation process， and ABA was enrichment in buds， the parts of flower bud differentiation occurred， indicating that ABA played a more important role in the process of flower bud differentiation of longan.

Key words Longan；Endogenous hormone；Flower bud differentiation

花芽分化是果樹產(chǎn)量形成的第一步。成花機(jī)理的探索一直是果樹學(xué)界最熱門的課題之一。正常情況下龍眼經(jīng)冬季低溫誘導(dǎo)成花，龍眼可由氯酸鉀誘導(dǎo)反季節(jié)成花，并形成產(chǎn)量，這使得經(jīng)典的花芽分化理論面臨新的挑戰(zhàn)。頂芽分化為葉芽或花芽的時(shí)期也是不同激素含量及其動(dòng)態(tài)平衡控制花芽分化的重要時(shí)期。因此，植物激素及其平衡在花芽分化中的作用顯得尤為重要。隨著植物激素對(duì)植物發(fā)育調(diào)控的研究不斷深入，人們從激素的角度探索了果樹成花的調(diào)控機(jī)理。激素所調(diào)控的成花信息的改變是由葉片產(chǎn)生并運(yùn)輸?shù)缴L(zhǎng)點(diǎn)，它激活了所謂的“開花基因”控制。Bangerth[1]認(rèn)為果樹從營養(yǎng)芽轉(zhuǎn)向花芽發(fā)育是一個(gè)不可逆的過程，需要植物激素瞬時(shí)變化來調(diào)控花芽的發(fā)端，但在龍眼、荔枝和柑橘的研究中發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)苛條件下花芽均可逆轉(zhuǎn)為葉芽，這使得傳統(tǒng)的激素調(diào)控成花的理論受到了挑戰(zhàn)，預(yù)示著更為復(fù)雜的激素變化在成花中的未知作用。

生長(zhǎng)素在成花中的作用存在爭(zhēng)議，在一些試驗(yàn)中IAA可以抑制花芽的形成，只要頂端供應(yīng)的IAA減少可以提高花芽形成[2]，但在草莓中的研究發(fā)現(xiàn)阻斷頂芽中IAA傳輸會(huì)延遲開花[3]。一般認(rèn)為GA可抑制果樹花芽分化，因此，在生產(chǎn)上應(yīng)用PP333、C.C.C.（矮壯素）和Daminozide等來抑制枝梢中吲哚乙酸或赤霉素的生成及轉(zhuǎn)運(yùn)，并允許細(xì)胞分裂素和其他產(chǎn)物的積累，以促進(jìn)花芽分化[4]。降低菊花紅光與遠(yuǎn)紅光比例導(dǎo)致腋芽中脫落酸（ABA）積累的升高，從而將更多的蔗糖驅(qū)向底部芽，ABA、SL和IAA均參與花芽調(diào)節(jié)過程[5]。對(duì)55個(gè)龍眼WRKY基因鑒定表明18個(gè)DlWRKY基因在“四季蜜”花誘導(dǎo)的3個(gè)階段顯示出特異性表達(dá)，可能是應(yīng)激或激素反應(yīng)基因[6]。檸檬花誘導(dǎo)過程中觀察到更高水平的ABA，通過RNA測(cè)序鑒定總共1 638個(gè)差異表達(dá)的基因（DEG），確定DEG與開花、激素生物合成或代謝有關(guān)[7]。蘋果分化芽的轉(zhuǎn)錄組分析顯示細(xì)胞分裂素（CK）、脫落酸（ABA）和赤霉酸途徑的復(fù)雜激素調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)參與誘導(dǎo)蘋果花形成。CK在細(xì)胞形成和分化的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，且影響開花相關(guān)基因的表達(dá)水平。同時(shí)，ABA信號(hào)通過參與糖介導(dǎo)的開花途徑調(diào)節(jié)蘋果花的誘導(dǎo)。此外，芽中糖和淀粉沉積水平的變化可受ABA含量和參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因表達(dá)的影響[8]。研究顯示生長(zhǎng)素（IAA）和赤霉素（GA）水平的下降，脫落酸（ABA）和細(xì)胞分裂素（CTK）水平的升高有利于果樹花芽分化，龍眼的成花也涉及這種激素環(huán)境[9]。Luckwill等[10]指出，細(xì)胞分裂素與赤霉素的平衡對(duì)蘋果成花過程起控制作用，對(duì)芒果和荔枝等的研究結(jié)果支持了Luckwill等[10]的假說。但迄今很少有對(duì)正造及反季節(jié)龍眼在成花過程中的激素水平做比較的研究。KClO3是如何調(diào)節(jié)龍眼樹體激素變化而誘導(dǎo)成花的機(jī)理尚不清楚，筆者比較了正造與反季節(jié)龍眼在花芽分化期各階段中iPA、GA、ABA、ZR、IAA含量變化動(dòng)態(tài)，及其與成花的關(guān)系，旨在為完善反季節(jié)龍眼成花機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為國家熱帶果樹品種改良中心5～6年生長(zhǎng)勢(shì)相近的‘儲(chǔ)良龍眼樹。正造龍眼采樣自末次冬梢老熟開始至側(cè)花原基形成后10 d止，每10 d采樣一次，共采樣6次。反季節(jié)龍眼抽生3次新梢的枝梢停止生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行反季節(jié)催花（氯酸鉀處理龍眼根際），采樣自催花之日開始至側(cè)花原基形成后7 d結(jié)束，每7 d采樣一次，共采樣6次。樣品包含葉片和頂芽。所有樣品均液氮速凍帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 方法

1.2.1 提取。

稱取0.5 g新鮮植物材料，加2 mL提取液（80%甲醇，內(nèi)含1 mmol/L BHT），在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，再用2 mL提取液將研缽內(nèi)殘留物轉(zhuǎn)入離心管中，搖勻后放置在4 ℃冰箱中4 h，10 000 r/min離心15 min，收集上清液。沉淀中加1 mL提取液混勻，置4 ℃下1 h后離心，合并2次提取的上清液并記錄體積。上清液過C18固相萃取柱后備用。

1.2.2 iPA、IAA、GA 純化。

取200 μL提取液用氮?dú)獯蹈?，并用試劑盒提供的樣品稀釋液定容?00 μL。

1.2.3 ABA、ZR 純化。

取2 mL提取液用氮?dú)獯蹈桑⒂迷噭┖刑峁┑臉悠废♂屢憾ㄈ莸?00 μL。

1.2.4 激素含量的測(cè)定。

采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定內(nèi)源激素含量，ELISA試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，測(cè)定激素包含ZR、IAA、GA、ABA、iPA，所有測(cè)定均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 iPA含量變化

正造樹葉片中iPA含量在花芽分化過程中逐漸上升，在側(cè)花原基形成時(shí)上升至最高水平（32.22 ng/g），隨后下降。與葉片相比，正造龍眼頂芽中的iPA含量較低，尤其在側(cè)花原基形成前30 d頂芽iPA含量?jī)H為0.93 ng/g，至側(cè)花原基形成時(shí)頂芽iPA含量達(dá)到最高峰11.85 ng/g，是葉片iPA含量的36.77%（圖1a）。催花之前反季節(jié)龍眼與正造龍眼iPA含量相近，但催花之后反季節(jié)龍眼iPA含量變化與正造有很大差別。反季節(jié)龍眼葉片和頂芽iPA含量在催花之后均顯著升高，反季節(jié)龍眼葉片中iPA含量在催花之后7 d達(dá)到催花前的8.72倍；在側(cè)花原基形成前14 d葉片中iPA含量下降至催花前水平。頂芽中iPA含量在催花后迅速上升，在側(cè)花原基形成前7 d達(dá)到峰值（12895 ng/g）（圖1b）。

iPA具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、地上部分化、側(cè)芽生長(zhǎng)、葉片擴(kuò)大及延緩葉片衰老等功能[11-15]。反季節(jié)龍眼由于打破了樹體原有的激素平衡而誘導(dǎo)成花，而頂芽中iPA的迅速累積并在側(cè)花原基形成時(shí)迅速消失或轉(zhuǎn)移，暗示了反季節(jié)龍眼側(cè)花原基分化對(duì)iPA的需求顯著高于正造。

2.2 GA含量變化

檢測(cè)了正造及反季節(jié)龍眼葉片和頂芽GA含量變化，并比較了花芽分化過程中葉片頂芽GA變化的差異。結(jié)果表明，無論是正造還是反季節(jié)龍眼，葉片和頂芽GA含量差別極大，尤以正造龍眼更顯著。在側(cè)花原基形成之前葉片GA含量持續(xù)上升，至冬梢老熟后20 d達(dá)32.77 ng/g，而在側(cè)花原基形成時(shí)正造龍眼葉片GA水平降至低谷（11.07 ng/g）。正造龍眼頂芽中GA含量變化與葉片有相同趨勢(shì)，但頂芽中GA含量極低，在冬梢老熟時(shí)僅為024 ng/g，在側(cè)花原基形成之前20 d達(dá)到最高，僅為5.82 ng/g，至側(cè)花原基完成時(shí)又下降至0.62 ng/g（圖2a）。KClO3處理導(dǎo)致反季節(jié)龍眼葉片中GA含量出現(xiàn)應(yīng)激性的上調(diào)，在催花后第7天達(dá)到峰值（39.78 ng/g），隨后下降至7.77 ng/g，并于側(cè)花原基形成前7 d達(dá)到第2個(gè)高峰19.26 ng/g，側(cè)花原基形成時(shí)略有下降，隨后與側(cè)花原基形成前7 d相持平。頂芽中GA含量與正造頂芽中GA變化有相同趨勢(shì)，在側(cè)花原基形成之前7 d上升最高值（26.40 ng/g），隨后下降。但反季節(jié)龍眼頂芽峰值比正造頂芽GA含量峰值高3.54倍（圖2b）。

GA的主要功能是打破休眠，其在頂芽向花芽轉(zhuǎn)變的過程中起著重要作用，而冬梢成熟時(shí)和夏梢抽生3次時(shí)，GA在頂芽中含量均下降，在側(cè)花原基形成之前均呈上升趨勢(shì)。這說明GA作為一種打破休眠的重要激素，其在龍眼營養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過程中起重要作用。

2.3 ABA含量變化

正造龍眼葉片和頂芽ABA含量在花芽分化前后有較大變化，其中葉片在花芽分化過程中持續(xù)平穩(wěn)上升，由初期的2.38 μg/g上升至側(cè)花原基形成后10 d時(shí)的14.87 μg/g。頂芽中ABA含量變化最大，初期頂芽中ABA含量較低，僅為葉片的2.09倍，但隨著花芽分化進(jìn)程的推進(jìn)，頂芽中ABA含量急速上升，僅在10 d后上升至21.04 μg/g，是初期時(shí)的4.23倍，隨后持續(xù)上升，在側(cè)花原基形成前10 d達(dá)到頂峰（30.42 μg/g），在側(cè)花原基形成時(shí)又迅速下降至11.69 μg/g（圖3a）。

反季節(jié)龍眼在催花之后葉片ABA含量變化幅度不大。側(cè)花原基形成之前葉片中ABA含量為6.4～8.6 μg/g，在側(cè)花原基形成時(shí)迅速下降至4.54 μg/g，并在側(cè)花原基形成后7 d又迅速上升。較葉片而言，反季節(jié)龍眼頂芽在整個(gè)花芽分化過程中有極高的ABA含量，在初期的14 d 呈緩慢上升趨勢(shì)，最高值達(dá)24.93 μg/g，隨后轉(zhuǎn)為緩慢下降趨勢(shì)，側(cè)花原基形成后7 d下降至11.89 μg/g（圖3b）。

低溫脅迫是誘導(dǎo)正造龍眼成花的必要條件；同時(shí)強(qiáng)氧化劑KClO3所誘導(dǎo)的反季節(jié)龍眼成花歸根到底也是由于氧化脅迫所致。脅迫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致ABA的積累，而ABA在植物中充當(dāng)了傳遞環(huán)境脅迫信號(hào)的第一信使[16-18]。在末次梢老熟時(shí)，正造與反季節(jié)龍眼頂芽均有較高的ABA含量，這說明頂芽是脅迫信號(hào)的感應(yīng)部位，在成花過程中具有重要的脅迫感應(yīng)作用。

2.4 IAA含量變化

正造樹在花芽分化過程中葉片和頂芽IAA含量變化不大。尤其在初期的20 d，葉片及頂芽IAA含量相近，均在2.0～2.4 μg/g，隨后30 d內(nèi)葉片IAA含量繼續(xù)維持在2.0～2.5 μg/g，而頂芽出現(xiàn)較大變化，在側(cè)花原基形成前10 d下降至1.75 μg/g，在側(cè)花原基形成時(shí)又上升至288 μg/g；在側(cè)花原基形成后10 d又下降至初期水平，降至211 μg/g（圖4a）。在整個(gè)花芽分化過程中，反季節(jié)龍眼葉片IAA含量在1.7～2.6 μg/g；而頂芽IAA含量呈“V”字形變化，初期頂芽IAA含量為2.50 μg/g，至側(cè)花原基形成前14 d下降至1.86 μg/g，之后開始回升，至側(cè)花原基形成時(shí)頂芽中IAA含量升至最高水平，達(dá)2.62 μg/g（圖4b）。

生長(zhǎng)素抑制矮牽牛成花的作用通過其對(duì)乙烯合成的刺激作用來實(shí)現(xiàn)[2]，但研究表明生長(zhǎng)素有促進(jìn)成花的作用[19-20]。在草莓整個(gè)花芽分化過程中，頂芽有IAA大量富集；IAA是對(duì)成花誘導(dǎo)的有效促進(jìn)劑，且頂芽生長(zhǎng)點(diǎn)可能是主要作用的部位，阻斷生長(zhǎng)素在草莓頂芽中的積累可以延緩花芽分化的進(jìn)程，并誘發(fā)異常花的發(fā)育[20]；由此可見IAA在成花中的作用還存在爭(zhēng)議。該研究發(fā)現(xiàn)在正造及反季節(jié)龍眼側(cè)花原基形成時(shí)，頂芽中IAA含量均達(dá)到最大值。因此認(rèn)為IAA可能具有促進(jìn)龍眼成花的作用。

2.5 ZR含量變化

龍眼葉片和頂芽ZR含量與IAA和ABA水平相比較低。正造龍眼葉片和頂芽ZR含量均在152 ng/g以下，且以頂芽ZR含量高。冬梢老熟時(shí)葉片中ZR含量?jī)H為40.56 ng/g，花芽分化過程中葉片ZR含量逐漸上升，至側(cè)花原基形成前20 d上升至87.15 ng/g，并在側(cè)花原基形成時(shí)達(dá)到最高水平（113.35 ng/g）。頂芽初期ZR含量明顯高于葉片，達(dá)137.24 ng/g，在側(cè)花原基形成前30 d達(dá)到最高值（151.54 ng/g）（圖5a）。反季節(jié)龍眼葉片和頂芽ZR含量高于正造龍眼，在催花初期尤為顯著。催花初期14 d葉片中ZR含量變化不大，在70.88～73.00 ng/g，在側(cè)花原基形成前7 d上升至99.74 ng/g，隨后緩慢下降。頂芽在催花之前有較高的ZR含量，催花后頂芽中ZR含量持續(xù)下降，至側(cè)花原基形成時(shí)降至93.96 ng/g（圖5b）。

ZR作為一種具有生理活性的細(xì)胞分裂素，具有誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽生成及延緩葉片衰老等功能[21]，研究表明ZR含量的上升有利于果樹成花[22]。KClO3處理打破了樹體固有的激素平衡而誘導(dǎo)成花，頂芽中ZR含量并未迅速累積，暗示ZR可能在龍眼花芽分化中無促進(jìn)作用。確切的結(jié)論還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)論與討論

研究表明，KClO3可以在反季節(jié)龍眼處理后28 d內(nèi)誘導(dǎo)側(cè)花原基形成。盡管開花調(diào)控所涉及的機(jī)制尚不明確，研究顯示KClO3誘導(dǎo)了龍眼葉和芽中內(nèi)源激素（ABA、GA、IAA、iPA和ZR）水平的變化。KClO3處理后28 d，涉及花芽分化的重要激素發(fā)生顯著變化。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KClO3處理導(dǎo)致花芽萌動(dòng)，ABA、GA和iPA水平增加，并且與正造季節(jié)龍眼的激素水平相比，IAA和ZR水平降低。

參考文獻(xiàn)

[1] BANGERTH F K.Can regulatory mechanism in fruit growth and development be elucidated through the study of endogenous hormone concentrations？[J].Acta Hort，1998，463：77-88.

[2] FRANKOWSKI K，KESY J，WOJCIECHOWSKI W，et al.Lightand IAAregulated ACC synthase gene（PnACS）from Pharbitis nil and its possible role in IAAmediated flower inhibition[J].J Plant Physiol，2009，166：192-202.

[3] HOU Z X，HUANG W D.Immunohistochemical localization of IAA and ABP1 in strawberry shoot apexes during floral induction[J].Planta，2005，222（4）：678-687.

[4] MEIJN M，CAAL M J，VALLEDOR L，et al.Epigenetic and physiological effects of gibberellin inhibitors and chemical pruners on the floral transition of azalea[J].Physiol Plant，2011，141（3）：276-288.

[5] YUAN C Q，AHMAD S，CHENG T R，et al.Red to farred light ratio modulates hormonal and genetic control of axillary bud outgrowth in Chrysanthemum（Dendranthema grandiflorum ‘Jinba）[J].Int J Mol Sci，2018，19（6）：1-21.

[6] JUE D W，SANG X L，LIU L Q，et al.Identification of WRKY gene family from Dimocarpus longan and its expression analysis during flower induction and abiotic stress responses[J].Int J Mol Sci，2018，19（8）：1-20.

[7] LI J X，HOU X J，ZHU J，et al.Identification of genes associated with lemon floral transition and flower development during floral inductive water deficits：A hypothetical model[J].Front Plant Sci，2017，8：1013.

[8] XING L B，ZHANG D，LI Y M，et al.Transcription profiles reveal sugar and hormone signaling pathways mediating flower induction in apple（Malus domestica Borkh.）[J].Plant Cell Physiol，2015，56（10）：2052-2068.

[9] SUSAWAENGSUP C，RAYANAKORN M，WONGPORNCHAI S，et al.Investigation of plant hormone level changes in shoot tips of longan（Dimocarpus longan Lour.）treated with potassium chlorate by liquid chromatographyelectrospray ionization mass spectrometry[J].Talanta，2011，85（2）：897-905.

[10] LUCKWILL L C，SILVA J M.The effects of daminozide and gibberellic acid on flower initiation，growth and fruiting of apple cultivar Golden Delicious[J].Journal of horticultural science，1979，54（3）：217-223.

[11] KUROHA T，TOKUNAGA H，KOJIMA M，et al.Functional analyses of LONELY GUY cytokininactivating enzymes reveal the importance of the direct activation pathway in Arabidopsis[J].Plant cell，2009，21（10）：3152-3169.

[12] IOIO R D，GALINHA C，F(xiàn)LETCHER A G，et al.A PHABULOSA/cytokinin feedback loop controls root growth in Arabidopsis[J].Curr Biol，2012，22（18）：1699-1704.

[13] FATIMA N，ANIS M.Role of growth regulators on in vitro regeneration and histological analysis in Indian ginseng（Withania somnifera L.）Dunal[J].Physiol Mol Biol Plants，2012，18（1）：59-67.

[14] HE D，MATHIASON K，F(xiàn)ENNELL A.Auxin and cytokinin related gene expression during active shoot growth and latent bud paradormancy in Vitis riparia grapevine[J].J Plant Physiol，2012，169：643-648.

[15] CHEN Y P，CHEN W，LI X L，et al.Knockdown of LjIPT3 influences nodule development in Lotus japonicus[J].Plant Cell Physiol，2014，55（1）：183-193.

[16] ZALEJSKI C，ZHANG Z S，QUETTIER A L，et al.Diacylglycerol pyrophosphate is a second messenger of abscisic acid signaling in Arabidopsis thaliana suspension cells[J].The plant journal，2005，42（2）：145-152.

[17] TUTEJA N，SOPORY S K.Chemical signaling under abiotic stress environment in plants[J].Plant Signal Behav，2008，3（8）：525-536.

[18] ZHANG F Y，LU X，LV Z Y，et al.Overexpression of the Artemisia orthologue of ABA receptor，AaPYL9，enhances ABA sensitivity and improves artemisinin content in Artemisia annua L.[J].PLoS One，2013，8：1-13.

[19] DE MELO FERREIRA W，KERBAUY G B，KRAUS J E，et al.Thidiazuron influences the endogenous levels of cytokinins and IAA during the flowering of isolated shoots of Dendrobium[J].J Plant Physiol，2006，163（11）：1126-1134.

[20] CHEN D，DENG Y T，ZHAO J.Distribution and change patterns of free IAA，ABP 1 and PM H+ATPase during ovary and ovule development of Nicotiana tabacum L.[J].J Plant Physiol，2012，169：127-136.

[21] BARCISZEWSKI J，MASSINO F，CLARK B F C.KinetinA multiactive molecule[J].Int J Biol Macromol，2007，40（3）：182-192.

[22] 艾軍，王英平，李昌禹，等.五味子花芽分化過程中3種內(nèi)源激素的消長(zhǎng)[J].中國中藥雜志，2006，31（1）：24-26.