胡文俐，李培旺，李昌珠，蔣麗娟，張良波，陳景震，馬英姿

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004；3.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004）

Pb、Zn重金屬土壤污染在我國較為嚴(yán)重，當(dāng)Pb2+、Zn2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過閾值時，就會對植物產(chǎn)生毒害[1]。鉛作為植物生長非必需元素，對植物產(chǎn)生毒害作用主要通過抑制植物種子萌發(fā)、根系和幼苗生長以及葉片的光合作用[2-3]。鋅是植物生長的必需元素，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鋅對植物生長產(chǎn)生促進(jìn)作用，過量的鋅不僅抑制種子萌發(fā)和根系生長，影響光合速率，使植物葉片變黃，甚至?xí)淖兗?xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞失活[4]。在自然環(huán)境中，鉛、鋅普遍共存，因而容易形成鉛鋅以及其它重金屬元素的復(fù)合污染[5]。目前，對超累積或富集植物修復(fù)重金屬污染做了較多篩選研究，但這些植物多因生物量小、生長速度慢，在實際應(yīng)用中受到限制，導(dǎo)致修復(fù)復(fù)合重金屬污染效果不理想[6]。

山蒼子Litsea cubeba(Lour.) Pers.是樟科木姜子屬落葉灌木或小喬木，為我國南方重要生物質(zhì)能源和香料樹種，具有生長快、生物量大、適應(yīng)性強(qiáng)、地理分布廣的特點[7]。本課題組通過前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)山蒼子在鉛鋅尾礦區(qū)生長良好，這表明其對鉛鋅具有一定的耐受性，具備作為重金屬污染地植物修復(fù)材料的基礎(chǔ)。本文中研究了鉛鋅脅迫對山蒼子幼苗生理生化特征的影響，以期為山蒼子修復(fù)鉛鋅污染土壤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

供試材料為山蒼子1年生實生苗，采自湖南省瀏陽苗圃，移栽前用去離子水將植株根部洗凈。將長勢基本相同的幼苗預(yù)培養(yǎng)20 d，再將其移至加入鉛鋅重金屬的盆中，鉛和鋅分別以Pb(NO3)2、ZnSO4·7H2O形態(tài)加入。每盆栽種5株幼苗，3個重復(fù)。以未經(jīng)重金屬處理的個體為對照（CK），試驗質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)計見表1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)計依據(jù)我國土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計[8]。

1.2 測定方法

處理后第21天取植株相同部位的葉片，測定其葉綠素、酶活性等生理生化指標(biāo)。葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛（MDA）、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的測定參照張志良[9]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用WPS2016整理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS 13.0進(jìn)行ANONA方差顯著性分析和LSD檢驗。

表1 試驗設(shè)計Table 1 Experiment design

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛鋅脅迫對山蒼子幼苗葉綠素的影響

在鉛鋅處理下，山蒼子的葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）、葉綠素a+b（Ct）、葉綠素a/b （Ca/Cb）的變化趨勢如圖1所示。在單一Pb2+處理下，當(dāng)Pb2+為200 mg/kg（P1）時，Cb、Ct含量達(dá)到最大值，較對照分別增加了36.38%、6.95%。當(dāng)Pb2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤600 mg/kg時，Ca、Ct含量較對照無顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)Pb2+為800 mg/kg時，Ca、Ct顯著低于對照（P＜0.05），較對照分別減少了25.10%、20.21%。在Zn2+處理下，Z1（Zn2+為200 mg/kg）脅迫下Cb、Ct均達(dá)到最大值，較對照分別增加了20.95%、2.63%。當(dāng)Zn2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤400 mg/kg時，Ca、Cb、Ct與對照差異均不顯著（P＞0.05）。當(dāng)Zn2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥600 mg/kg（Z3、Z4）時，Ca、Ct均顯著低于對照（P＜0.05），較對照分別下降了20.81%、28.70%、15.91%、22.98%。在單一Pb2+、Zn2+處理下，Ca均逐漸下降，Cb、Ct均呈先增后減的趨勢。

在Pb2++Zn2+脅迫下，Ca、Cb、Ct均表現(xiàn)出先增后減的趨勢，當(dāng)復(fù)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤600 mg/kg時，Ca、Cb、Ct值均高于對照，且高于相同離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Pb2+、Zn2+單一處理下的各值。在M2處理下，Ca、Cb、Ct達(dá)到最大值，最大值分別為1.29、0.57、2.87 mg/g。在M4處 理 下，Ca、Ct顯著低于對照（P＜0.05），Cb與對照差異不明顯（P＞0.05）。另外，Ca/Cb值在3種脅迫下均逐漸下降，在P4、Z4、M4處理下較對照組下降顯著（P＜0.05）。

圖1 鉛鋅脅迫下山蒼子幼苗葉綠素值的變化Fig.1 Changes of chlorophyll value of Litsea cubeba seedling under stress of Pb2+ and Zn2+

2.2 鉛鋅脅迫對山蒼子幼苗抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量的影響

圖2顯示，葉片內(nèi)SOD、POD、CAT活性隨著處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先上升后下降的趨勢，SOD酶活性峰值在Pb2+、Zn2+、Pb2++Zn2+處理下均出現(xiàn)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為400 mg/kg時，且Pb2++Zn2+處理下的SOD峰值最大，達(dá)740.40 U/g。POD、CAT酶活性在Pb2+處理下峰值均出現(xiàn)在P2處理，分別是對照的2.36、2.77倍。在Zn2+、Pb2++Zn2+處理下，POD、CAT酶活性峰值均出現(xiàn)在Z3和M3處理下，分別是對照的3.39、5.48和2.72、2.89倍。3種脅迫方式下，抗氧化酶活性均在800 mg/kg時達(dá)到最小值。這表明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鉛鋅對SOD、POD、CAT酶活性表現(xiàn)出不同程度的激活作用。但在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Zn2+、Pb2++Zn2+（≥600 mg/kg）脅迫下，葉片內(nèi)的POD、CAT酶活性比同質(zhì)量分?jǐn)?shù)單一Pb2+脅迫下更強(qiáng)，植物受到的損害更嚴(yán)重。隨著脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，山蒼子體內(nèi)的抗氧化酶平衡系統(tǒng)遭到破壞，從而導(dǎo)致酶活性快速下降。

圖2表明，3種脅迫下，山蒼子葉片內(nèi)MDA含量均處于上升趨勢，在P4、Z4、M4處理下分別達(dá)到最大值。這表明隨著處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，山蒼子體內(nèi)MDA的含量有所上升，幼苗受到的傷害逐漸加大。幼苗葉片內(nèi)MDA含量在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2++Zn2+（≤400 mg/kg）處理下比相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2+、Zn2+單一處理下低，在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2++Zn2+（＞400 mg/kg）脅迫下MDA含量比相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2+、Zn2+單一脅迫下高，說明植物在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2++Zn2+處理下細(xì)胞膜質(zhì)受損程度相對較輕，在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2++Zn2+處理下細(xì)胞膜質(zhì)損害相對嚴(yán)重。

圖2 鉛鋅脅迫下山蒼子幼苗葉片SOD、POD、CAT、MDA含量的變化Fig.2 Changes of SOD,POD,CAT,MDA contents of Litsea cubeba seedling leaf under stress of Pb and Zn

2.3 鉛鋅脅迫對山蒼子幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響

由圖3可知，在Pb2+、Zn2+及Pb2++Zn2+處理下，葉片可溶性糖、可溶性蛋白含量隨著處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大均呈先增后減的趨勢，可溶性糖分別在P2、Z1、M2處理下達(dá)到最大值，分別為8.98、7.52、11.67 mg/g。可溶性蛋白含量分別在P2、Z1、M1處理下達(dá)到最大值，較對照分別增加了32.20%、12.58%、41.74%。當(dāng)脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞400 mg/kg時，隨著脅迫程度的加大，糖、蛋白含量在3種脅迫下均顯著下降（P＜0.05），但下降趨勢各不相同。在單一Zn2+處理下，當(dāng)Zn2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞200 mg/kg時，山蒼子葉片中可溶性糖、蛋白開始下降；在Z4處理下，糖和蛋白含量為所有處理組中的最小值。

圖3還顯示，葉片內(nèi)脯氨酸含量隨著Pb2+、Zn2+、Pb2++Zn2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大持續(xù)上升，且均在脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)為800 mg/kg時達(dá)到最大值。當(dāng)脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)為600、800 mg/kg時，Pb2++Zn2+脅迫下脯氨酸含量均高于相同離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Pb2+、Zn2+單一脅迫下含量。

2.4 各生理指標(biāo)與3種處理之間的相關(guān)性

由相關(guān)性分析可知，葉綠素a與鉛鋅脅迫之間的相關(guān)系數(shù)均大于葉綠素b與其相關(guān)系數(shù)，說明葉綠素a對鉛鋅脅迫比葉綠素b更敏感。鉛鋅3種脅迫與葉綠素值的相關(guān)性大小為Zn2+＞Pb2+＞Pb2++Zn2+。SOD與3種脅迫的相關(guān)性大小為Zn2+＞Pb2+＞Pb2++Zn2+；POD與其相關(guān)性大小為Zn2+＞Pb2++Zn2+＞Pb2+；CAT與其相關(guān)性大小為Pb2++Zn2+＞Zn2+＞Pb2+。說明Zn2+和Pb2++Zn2+脅迫與抗氧化酶活相關(guān)性較大。可溶性糖與Pb2+、Zn2+處理均為負(fù)相關(guān)，與Pb2++Zn2+處理呈正相關(guān)，可見一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Pb2++Zn2+對可溶性糖的形成具有促進(jìn)作用。可溶性蛋白含量與Zn2+處理之間相關(guān)性達(dá)顯著水平，說明Zn2+對蛋白含量影響較大。山蒼子葉片內(nèi)脯氨酸含量與3種處理均達(dá)到極顯著正相關(guān)，相關(guān)性大小為：Zn2+＞Pb2++Zn2+＞Pb2+。

圖3 鉛鋅脅迫下山蒼子幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的變化Fig.3 Changes of soluble sugar,soluble protein and free proline content of Litsea cubeba seedling leaf under stress of Pb and Zn

表2 鉛鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)與山蒼子幼苗生理生化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析?Table 2 Correlation analysis between the concentration of Pb,Zn and the physiological and biochemical indices of Litsea cubeba seedlings

3 討論與結(jié)論

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量的高低直接反映植物光合作用和生長能力的強(qiáng)弱，它也用于指示逆境下植物組織、器官的衰老情況[10-12]。本研究結(jié)果表明，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2+、Zn2+（離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤400 mg/kg）對山蒼子葉綠素的合成具有輕微的促進(jìn)作用，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2+、Zn2+（離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥600 mg/kg）明顯抑制葉綠素的合成，說明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)重金屬對植物的損害較大[13]。Pb2++Zn2+復(fù)合脅迫在離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤400 mg/kg時增加了葉綠素a、b、a+b的含量，這可能是Pb2+、Zn2+復(fù)合作用使山蒼子對其中一種或兩種重金屬元素的吸收減少所致，但其影響較為復(fù)雜，具體作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究[14]。葉綠素各值的變化趨勢還表明，葉綠素b含量受鉛鋅影響最小，葉片光合色素對鉛鋅的敏感程度為葉綠素a＞葉綠素b。

SOD、POD、CAT 3種酶在植物體內(nèi)形成抗氧化系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以有效清除活性氧自由基。抗氧化酶活性上升和下降與植物的抗性強(qiáng)弱有關(guān)，抗性強(qiáng)的植物在逆境條件下能使酶活性維持在較高水平[15-16]。山蒼子體內(nèi)抗氧化酶活性在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2+、Zn2+及Pb2++Zn2+脅迫下逐漸上升，在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)（離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞600 mg/kg）脅迫下體內(nèi)SOD、POD、CAT酶活性下降，但仍保持在較高水平。說明在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)重金屬脅迫下，植株體內(nèi)的防御機(jī)能被激發(fā)，抗氧化酶活性迅速上升以應(yīng)對重金屬引起的活性氧增加所帶來的危害。但隨著脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，重金屬在植物體內(nèi)累積，使得植株生理代謝紊亂，抗氧化酶活性受到抑制并開始下降[17]。該研究表明抗氧化酶在山蒼子應(yīng)對鉛鋅脅迫的過程中發(fā)揮了積極作用。因此，山蒼子可通過自身代謝降低鉛鋅重金屬的毒害，增強(qiáng)對鉛鋅的耐受性。

植物在逆境下，機(jī)體細(xì)胞一般會發(fā)生膜脂過氧化，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量的多少可以反映植物遭受逆境傷害的程度大小[18]。山蒼子幼苗MDA含量在3種脅迫下均隨著脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而逐漸上升，葉片內(nèi)MDA含量在鉛鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為800 mg/kg時均達(dá)到最大值，此時植株內(nèi)細(xì)胞膜質(zhì)的過氧化程度最高，細(xì)胞膜受損程度最為嚴(yán)重[19]。這與鉛、鎘脅迫下中華結(jié)縷草和皺葉酸模內(nèi)MDA含量以及銅鋅復(fù)合脅迫下蘆竹內(nèi)MDA含量變化結(jié)果一致[20-21]。

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸作為細(xì)胞膜滲透性保護(hù)物質(zhì)，其含量可反映植物在遭受重金屬毒害時對外界環(huán)境的適應(yīng)能力大小[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在Pb2+、Zn2+及Pb2++Zn2+處理下，山蒼子可溶性糖、可溶性蛋白含量均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，這說明山蒼子在受到重金屬脅迫時，通過調(diào)節(jié)碳、氮代謝產(chǎn)物的平衡關(guān)系，提高了植物體對鉛鋅脅迫的耐性[23]。這與張靜等[24]的研究結(jié)果一致。低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鉛鋅脅迫促進(jìn)山蒼子幼苗體內(nèi)可溶性糖和蛋白的合成，使得山蒼子在逆境下的抗性增強(qiáng)。隨著脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)鉛鋅脅迫使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致植物滲透調(diào)節(jié)失衡，阻礙了可溶性糖、可溶性蛋白的合成，從而對幼苗產(chǎn)生毒害[25]。機(jī)體內(nèi)脯氨酸的含量與植物抗逆性的能力緊密相關(guān)[26]，山蒼子葉片中脯氨酸的含量在3種脅迫下持續(xù)上升，產(chǎn)生這種情況的原因可能是當(dāng)鉛鋅含量較低時，對幼苗毒害作用相對較小，但隨著處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，山蒼子體內(nèi)的正常代謝和酶系統(tǒng)遭到破壞，迫使植物機(jī)體做出更為復(fù)雜的應(yīng)急反應(yīng)，導(dǎo)致大量脯氨酸累積[27]。

在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)復(fù)合處理下，山蒼子葉綠素各值變化趨勢與Pb2+、Zn2+單一處理下相同，但高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2++Zn2+脅迫（離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞600 mg/kg）較同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2+、Zn2+單一脅迫對葉綠素含量具有更顯著的抑制作用。另外，本研究中的相關(guān)性分析表明，重金屬Zn2+對山蒼子的生長影響較大。在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Zn2+、Pb2++Zn2+（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥600 mg/kg）脅迫下，葉片內(nèi)的POD、CAT酶活性比同質(zhì)量分?jǐn)?shù)單一Pb2+脅迫下更強(qiáng)，植物損壞程度更嚴(yán)重，這與易心鈺[28]研究的蓖麻對鉛鋅脅迫的響應(yīng)及其機(jī)制的研究結(jié)果基本一致?？赡苁且驗橹亟饘賈n2+作為植物生長的必需元素，當(dāng)其含量超過植物所需時，山蒼子體內(nèi)的酶系統(tǒng)遭受的破壞更嚴(yán)重，對植物的生長影響更大[5]。而且在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2++Zn2+脅迫下幼苗抗氧化酶活性、脯氨酸、丙二醛含量均高于相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2+、Zn2+單一脅迫。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Pb2++Zn2+復(fù)合脅迫下，Pb2+與Zn2+表現(xiàn)為協(xié)同作用，對植株毒害作用增強(qiáng)，這與楊玲等[29]研究的Pb、Zn脅迫對狗牙根和早熟禾的研究結(jié)果相同。不過復(fù)合污染體系中重金屬的復(fù)合作用是一個復(fù)雜的問題，它與重金屬的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)組合、植物所處生命階段、植物種類、脅迫時間及脅迫方式等諸多因素有關(guān)[30]。

通過盆栽試驗，初步證明了山蒼子對鉛鋅具有較強(qiáng)的耐受性，且山蒼子為南方地區(qū)的優(yōu)勢植物，可用于修復(fù)鉛鋅污染土壤，并可有效避免外來物種入侵，維護(hù)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)的平衡[31-32]。但在自然環(huán)境中鉛鋅污染要比盆栽試驗復(fù)雜得多，植物對重金屬吸收的影響還受土壤性質(zhì)、土壤微生物及根際環(huán)境的影響，以后的研究可放在不同土壤類型的大田中進(jìn)行[33]，而且可進(jìn)一步從組織化學(xué)和分子水平上探討山蒼子的耐性機(jī)理，以確定重金屬對山蒼子的作用機(jī)制。另外，作為經(jīng)濟(jì)作物的山蒼子，其果實中重金屬的含量必須確定是否超標(biāo)，以防通過食物鏈進(jìn)入人體，對人體造成危害[34]。