葡萄籽原花青素對糖尿病小鼠腎臟氧化應(yīng)激的作用及對HO-1的影響

丁玉松，冉珊珊，毛磊，竇璇，李悅

(石河子大學醫(yī)學院預(yù)防醫(yī)學系，新疆 石河子 832000)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一種由于胰島素不足或機體利用胰島素不足所引起的慢性疾病[1]。糖尿病的長期高糖高脂環(huán)境會引起機體氧化應(yīng)激、抗氧化能力損傷等反應(yīng)從而產(chǎn)生糖尿病腎病等多種嚴重并發(fā)癥[2]。在I型糖尿病并發(fā)癥中，糖尿病腎病對機體的危害位于第一。在II型糖尿病中僅次于心、腦血管的影響[3]。

葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidinsextract, GSPE)是葡萄籽內(nèi)一種富含多酚類的提取物，具有清除自由基、提高抗氧化能力、調(diào)節(jié)血糖血脂的作用[4-6]。近年來，糖尿病在低收入國家患病率增長速度超過高收入國家，本研究就GSPE對小鼠糖尿病腎臟氧化應(yīng)激的作用進行實驗研究，擬為糖尿病腎病的防治尋找價格適中、效果明顯的保健品及藥品提供實驗依據(jù)，探討HO-1在糖尿病發(fā)展中的作用以及GSPE是否對HO-1的表達產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

90只健康的ICR雄性小鼠，體重(25±2) g。小鼠飼料為標準飼料。

1.2 實驗儀器與試劑

實驗儀器：卓越精采型-NC羅氏血糖儀(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)，F(xiàn)A1604電子精密天平(上海浦春計量儀器有限公司)，X-mark酶標儀(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)，HH.W21.600型恒溫水浴箱(美國 Bio-Rad公司)，TG16G高速離心機(新發(fā)現(xiàn)科技有限公司)，手動玻璃勻漿器(上海壘固生物工程公司)，葡萄籽提取物(純度95.0%，上?；瘜W試劑公司)，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛檢測試劑盒(上海陸恒生物工程研究所)，谷胱甘肽、血紅素加氧酶-1檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，四氧嘧啶(上?；瘜W試劑公司)。

1.3 糖尿病大鼠模型的建立與分組

取90只健康ICR小鼠，隨機選擇60只為造模組。剩余30只隨機分為正常對照組(正常組、正常+低濃度GSPE組和正常+高濃度GSPE組)。造模組小鼠禁食12 h后，腹腔注射200 mg/kg四氧嘧啶，24 h后采血測血糖，隨機血糖>11.0 mmol/L的小鼠為糖尿病成功模型。最終30只進入模型組，并將其按體重隨機分為3組(DM組、DM+低濃度GSPE組和DM+高濃度GSPE組)。

1.4 給藥劑量及處理

每天同一時間灌胃給藥1次，連續(xù)6周。根據(jù)小鼠體重，給予正常對照組100 mg/kg生理鹽水20 mg/kg，給予正常+低濃度GSPE組100 mg/kg GSPE20 mg/kg，給予正常+高濃度GSPE組400 mg/kg GSPE 20 mg/kg，給予DM組100 mg/kg生理鹽水20 mg/kg，給予DM+低濃度GSPE組100 mg/kg GSPE 20 mg/kg，給予DM+高濃度GSPE組400 mg/kg GSPE 20 mg/kg。實驗中，記錄每天飲水量，每周測量1次體重和1次血糖。灌胃6周后處死動物，眼眶取血，將血液3 500 r/min，4 ℃離心15 min，隨后取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆茫煌瑫r，制備腎臟勻漿取肝組織入液氮速凍。

1.5 檢測指標及測定方法

1.5.1 生化指標檢測

每周測1次血糖，試驗結(jié)束后，取小鼠血清。按照說明測量甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)。

1.5.2 氧化損傷指標檢測

容量法檢測過氧化氫酶(CAT)活性。按試劑盒說明檢測丙二醛(MDA)的含量。用ELISA法檢測血紅素加氧酶-1(HO-1)的含量。

1.5.3 抗氧化指標檢測

用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶-亞硝酸鹽法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性。用DNTB比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。用Beutler改良法檢測谷胱甘肽(GSH)含量。用用ELISA法檢測血紅素加氧酶-1(HO-1)的含量。

1.6 統(tǒng)計學分析

各組試驗數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布以進行描述。應(yīng)用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)，組間差異分析用F檢驗和LSD檢驗。P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實驗過程中，正常組小鼠一般情況正常、毛發(fā)光亮、動作敏捷，糖尿病組小鼠一般情況欠佳，出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、血糖含量變高、飲水量增多、體重增長緩慢、毛發(fā)粗糙等癥狀，GSPE干預(yù)的DM小鼠與DM小鼠組相比情況不同程度緩解。

各實驗組小鼠體重如圖1所示，第1～3周各組小鼠體重增長無顯著差異(P>0.05)，第4周開始模型組中DM組與GSPE干預(yù)組小鼠體重增長緩慢，體重均低于正常對照組(P<0.001)，GSPE干預(yù)各組與DM組相比體重較高(P<0.05)。

圖1 GSPE干預(yù)對實驗小鼠體重的影響Fig.1 Effects of GSPE intervention on weight in exper imental mice

GSPE干預(yù)對實驗血糖的影響(圖2)，1～4周時，與正常對照組比較，模型組血糖濃度較高(P>0.001),5～6周時，模型組比正常對照組血糖高(P<0.001)，模型組內(nèi)GSPE干預(yù)組與DM組相比血糖較低(P<0.001)，GSPE對正常組影響無差異(P>0.05)。

圖2 GSPE干預(yù)對實驗小鼠血糖的影響Fig.2 Effects of GSPE intervention on blood glucose in exper imental mice

2.2 GSPE干預(yù)對實驗小鼠TG、TC的影響

圖3 6周后各組實驗小鼠總膽固醇、甘油三酯含量Fig.3 Total cholesterol and triglyceride content in each group after 6 weeks

不同組小鼠之間TG與TC存在差異(FTG=37.01，P<0.05；FTC=10.64，P<0.05)。

與正常對照組比較，模型組各組小鼠的TG和TC有所增高(P<0.05)；與DM組比較，GSPE干預(yù)的各組DM小鼠TG、TC隨著GSPE濃度升高有所降低(P<0.05)；GSPE對正常組TG和TC影響不明顯(P>0.05)，(圖3)。

2.3 GSPE干預(yù)對實驗小鼠腎臟功能指標的影響

不同組小鼠體內(nèi)BUN與CRE存在差異(FBUN=53.13，P<0.05；FCRE=1268.85，P<0.05)。

與正常對照組小鼠比較，模型組的BUN和CRE濃度增高(P<0.05)，與DM組比較，GSPE干預(yù)的各組DM小鼠BUN、CRE隨著GSPE濃度升高有所下降(P<0.05)；GSPE對正常組小鼠體內(nèi)的BUN和CRE影響不明顯(P>0.05)(表1)。

表1 GSPE干預(yù)對實驗小鼠腎功的影響Tab.1 the effect of GSPE intervention on renal function in experimental mice

注：a：與正常組比較，P<0.05，b：與DM組比較，P<0.05。

2.4 GSPE干預(yù)對實驗小鼠氧化損傷指標的影響

不同組實驗小鼠之間MDA、SOD均存在差異(FMDA=15.40，P<0.05；FSOD=28.08，P<0.05)。

與正常對照組小鼠比較，模型組的SOD有所下降(P<0.05)，MDA有所上升(P<0.05)；與DM組相比較，GSPE干預(yù)的各組DM小鼠SOD隨著GSPE濃度升高有所上升(P<0.05)，MDA隨著GSPE濃度升高有所下降(P<0.05)；GSPE干預(yù)對正常組小鼠體內(nèi)的MDA、SOD影響不明顯(P>0.05)(表2)。

表2 GSPE干預(yù)對實驗小鼠氧化損傷指標的影響Tab.2 Effect of GSPE intervention on oxidative damage index in experimental mice

注：a：與正常組比較，P<0.05；b：與DM組比較，P<0.05。

2.5 GSPE干預(yù)對實驗小鼠抗氧化酶系的影響

GSPE干預(yù)對實驗小鼠抗氧化酶系的影響結(jié)果見表3。

表3 GSPE干預(yù)對實驗小鼠氧化抗氧化酶系的影響Tab.3 effects of GSPE intervention on antioxidant enzyme system in experimental mice

注：a：與正常組比較，P<0.05；b：與DM組比較，P<0.05。

本次實驗結(jié)果表明不同組實驗小鼠之間GSH-Px、GSH、CAT均存在差異(FGSH-Px=75.14，P<0.05；FGSH=27.46，P<0.05；FCAT=24.80，P<0.05)；與正常組相比模型組各組的GSH-Px、GSH、CAT均有所下降(P<0.05)；與DM組相比較，GSPE干預(yù)的DM小鼠的GSH-Px、GSH、CAT均隨著GSPE濃度升高有所上升(P<0.05)；GSPE干預(yù)對正常組小鼠體內(nèi)的GSH-Px、GSH、CAT影響不明顯(P>0.05)(表3)。

2.6 GSPE干預(yù)對實驗小鼠HO-1的影響

不同組實驗小鼠之間HO-1均存在差異(FHO-1=36.7，P<0.05)；與正常組小鼠比較，模型組各組的HO-1有所下降(P<0.05)；與DM組比較，GSPE干預(yù)各組HO-1隨著GSPE濃度升高有所上升(P<0.05)；GSPE干預(yù)對正常組小鼠體內(nèi)的HO-1影響不明顯(P>0.05)(表4)。

表4 GSPE干預(yù)對實驗小鼠HO-1的影響Tab.4 the effect of GSPE intervention on HO-1 in experimental mice

注：a：與正常組比較，P<0.05；b：與DM組比較，P<0.05。

3 討論

DM的發(fā)展是一個漸進過程，目前研究表明DM長期的高糖狀態(tài)會引發(fā)氧化應(yīng)激同時損害抗氧化系統(tǒng)，加速糖尿病的進一步發(fā)展[7]。腎臟是對氧化應(yīng)激損害及其敏感的，過多的活性氧會促進高血糖-AngII I型受體-活性氧的產(chǎn)生形成惡性循環(huán)導(dǎo)致腎小球高壓，加重腎臟損害。同時腎臟內(nèi)具有諸多抗氧化酶系，過多的活性氧使抗氧化酶系發(fā)生氧化，抗氧化能力下降，從而導(dǎo)致腎臟細胞受損，促進糖尿病腎病的形成[8]。

同時DM高脂狀態(tài)也會損害胰島β細胞加速糖尿病進程，引起血清中TG、TC水平升高形成惡性循環(huán)，本實驗表明GSPE具有降低體內(nèi)血清中TG和TC水平，改善脂代謝紊亂的作用，與王俊等[9]研究結(jié)果相同。GSPE中含有大量酚羥基，所以它對過氧化自由基具有超強的清除力[10]，因此GSPE可以增強其抗氧化能力，本實驗也證實了GSPE能有效降低糖尿病小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA、BUN、Cre的含量，增加GSH-Px、GSH、CAT的濃度，改善腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高小鼠抗氧化的能力，與肖俊松等[11]研究結(jié)果相同。

HO-1是血紅素催化過程中的重要限速酶，也是關(guān)鍵的抗氧化酶。但是在DM的末期，體內(nèi)HO-1的產(chǎn)生會受到抑制[12]。本實驗結(jié)果顯示，糖尿病小鼠體內(nèi)HO-1含量低于GSPE干預(yù)的糖尿病組，因此GSPE具有升高DM小鼠體內(nèi)HO-1濃度提高抗氧化能力的作用。Nrf-2具有誘導(dǎo)基因?qū)寡趸磻?yīng)的作用[13]，Niture等[14]研究表明口服GSPE可以提高組織中Nrf-2蛋白的表達，進而增強腎臟組織抗氧化能力，并且周禮華[15]等研究表明原花青素能夠促進Nrf-2誘導(dǎo)HO-1下游基因的表達，從而可以緩解氯氰菊酯引起的氧化損傷。因此我們猜想GSPE是否能夠通過Nrf-2信號通路上調(diào)HO-1的表達提高腎臟的抗氧化能力，具體機制有待進一步研究。

GSPE廣泛存在于食物中，實驗表明GSPE對正常機體的影響不大，無明顯毒副作用，但對于糖尿病對機體血脂血糖的影響以及對腎臟引起的氧化損傷有明顯作用，這暗示GSPE對糖尿病腎臟病變的發(fā)生發(fā)展可能具有潛在的防治作用，因此GSPE其對糖尿病腎病的影響著廣闊的研究前景。