宋偉 涂小寶 祁慧晨 徐加發(fā) 田丹碧

摘要：在合成DNA的熒光探針[Ru（bpy）2dppz]2+（RuBD）的過程中，初步發(fā)現(xiàn)了其特別的分子光開關(guān)特性，不僅取決于雙鏈DNA（dsDNA）還取決于單鏈DNA（ssDNA）。當(dāng)RuBD與水溶液中的DNA酶結(jié)合時，熒光強度在dsDNA / RuBD和ssDNA / RuBD之間顯示出明顯的差異。此外在實驗中，發(fā)現(xiàn)ssDNA / RuBD比dsDNA / RUDB的熒光更強，故我們采用熒光光譜，熒光顯微鏡和電化學(xué)法等方法，進一步研究RuBD與ssDNA的性質(zhì)。

關(guān)鍵詞：釕（Ⅱ）多吡啶配合物;分子光開關(guān);單鏈DNA（ssDNA）;雙鏈DNA（dsDNA）

雖然釕（Ⅱ）多吡啶配合物 [Ru（bpy）2（dppz）]2+作為核酸的光譜探針已有二十多年的歷史，其獨特的性質(zhì)在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、診斷和治療方面的應(yīng)用前景直到最近才受到重視[1-5]。作為體外和離體的理想探針，它已被用于實時跟蹤技術(shù)，該技術(shù)使用熒光顯微鏡監(jiān)測活細(xì)胞中的單個病毒組分或DNA序列，因為它們具有強烈的雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合親和力，低背景輻射、長壽命光開關(guān)效應(yīng)和紅移發(fā)射[6-9]。

RuBD的光開關(guān)效應(yīng)普遍認(rèn)為歸因于dsDNA堿基之間高度平面dppz配體的插入[1，10-13]，使得條帶研究和應(yīng)用僅涉及dsDNA。單鏈DNA （ssDNA）的光開關(guān)效應(yīng)似乎被忽略，對它的研究很少。

在設(shè)計以RuBD為熒光探針的Pb2+熒光傳感器過程中，我們首先發(fā)現(xiàn)RuBD的光開關(guān)效應(yīng)不僅依賴于與dsDNA的結(jié)合，還依賴于與ssDNA的結(jié)合。我們進一步采用熒光光譜法、熒光顯微鏡等，研究ssDNA對RuBD的性質(zhì)。我們希望我們的發(fā)現(xiàn)有助于更清楚地呈現(xiàn)RuBD DNA的結(jié)合機制，對其未來的生物應(yīng)用提供新思維，RuBD在新型診斷劑方面具有重要應(yīng)用價值，此類診斷劑不僅適用于雙鏈DNA /單鏈DNA，以及用于核酸位點和結(jié)構(gòu)的通用治療[14-18]和生物化學(xué)探針設(shè)計[19-21]。

[Ru（bpy）2（dppz）]（BF4）2 的合成遵循文獻[22，23]，采用熒光光譜法研究RuBD的結(jié)合性能。結(jié)果表明，與雙鏈DNA結(jié)合的RuBD熒光明顯增強，說明RuBD的結(jié)合作用（圖1）。

我們在脫氧核酶（DNAzyme）裂解反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)了RuBD的特殊性質(zhì)，它可以在ssDNA存在時產(chǎn)生顯著的熒光效應(yīng)，這一特性這已被應(yīng)用于制備Pb2+ 生物傳感器 [24]。

8-17 ssDNA，是一種對Pb2+有特異性催化作用的單鏈DNA分子。這種DNA分子生產(chǎn)成本低，可多次變性和復(fù)性且不喪失活性或結(jié)合能力，特別是其催化鏈可以借助Pb2+，催化底物鏈的裂解[25，26]。

在我們最初的設(shè)計策略中，僅僅基于RuBD與dsDNA的結(jié)合能力，故選用RuBD作為熒光探針。但在試驗過程中，結(jié)果超出了我們的預(yù)期。

熒光光譜可以發(fā)下RuBD在5mM Tris緩沖溶液中具有可忽略的熒光（圖2，粉紅色三角形點）。當(dāng)RuBD與8-17 dsDNA溶液混合時，熒光強烈發(fā)射（紅色圓點），證明了RuBD典型的光開關(guān)特性。通過添加Pb2+，8-17 dsDNA核酶水解成8-17 ssDNA和一些底物片段。如果RuBD的光開關(guān)效應(yīng)僅取決于dsDNA的插入，那么含有8-17 ssDNA和信號鏈底物片段的混合液的熒光強度將降低或檢測不到。但令人驚訝的是，該混合溶液的熒光強度顯著增強（～75%）（黑色四角點）。

用一種特殊設(shè)計的GR-5 DNA核酶進行DNA的裂解反應(yīng)，其性能與8-17 DNA核酶相似。發(fā)現(xiàn)該溶液的熒光強度也增大，說明RuBD與雙鏈DNA可以產(chǎn)生較強熒光，也可以與單鏈DNA產(chǎn)生較強熒光。為了驗證RuBD的分子熒光開關(guān)性能，我們分別使用DNA dsDNA和ssDNA溶液（8-17 dsDNA和8-17ssDNA，GR-5 dsDNA和GR-5 ssDNA）測試熒光強度。 通過向溶液中添加等量的RuBD，產(chǎn)生的熒光強度如圖3，由此我們發(fā)現(xiàn)，ssDNA / RuBD的熒光強度增強尤其顯著，約增強250%（GR-5 ssDNA/RuBD，綠色三角形點）和300%（8-17ssDNA/ RuBD，藍(lán)色四角點）。

為了進一步確認(rèn)RuBD的熒光特性，我們設(shè)計了兩個長度相同但結(jié)構(gòu)不同的DNA，其中一個（DNA/H）呈發(fā)夾狀，另一個（DNA/S）呈直線狀。圖4顯示，在相同條件下，RuBD與DNA/S結(jié)合產(chǎn)生的熒光強度強于DNA/H，且與熒光顯微鏡圖像結(jié)果一致。 與DNA/H相比，RuBD與單鏈DNA/S結(jié)合產(chǎn)生更強更顯著的熒光特性。

RuBD可能通過靜電作用與ssDNA結(jié)合，盡管聯(lián)吡啶配體部分插入的可能性不能完全消除[28-31]。我們采用循環(huán)伏安法（CV）進一步考察。通過巰基-金的相互作用，將5'末端具有硫醇的ssDNA固定在工作電極金電極表面。將ssDNA修飾的電極在封閉試劑MCH溶液中進一步孵育，以獲得良好排列的DNA單層，防止RuBD進入電極表面。分別在緩沖液（a）和RuBD溶液（b）中對修飾電極進行循環(huán)掃描，在RuBD溶液中電流峰值明顯增強（見圖5）。采用計時庫侖法進行實驗，也具有一致的結(jié)果。由于RuBD的靜電吸附，峰值電流可歸因于表面受限的氧化還原過程，證明了我們先前假設(shè)的吸附作用（圖6）。

綜上所述，釕（Ⅱ）多吡啶配合物（RuBD）不僅可以插入dsDNA，還可以插入ssDNA，值得引起我們關(guān)注的是，其和ssDNA作用時產(chǎn)生的熒光強度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dsDNA。我們希望關(guān)于RuBD的分子光開關(guān)特性能引起科學(xué)界的關(guān)注，其在化學(xué)傳感、生物傳感、生物示蹤、熒光成像、超分辨成像等領(lǐng)域表現(xiàn)出極大的潛在應(yīng)用價值，值得進一步研究開發(fā)。

參考文獻：

[1]Erkkila， K. E.; Odom， D. T.; Barton， J. K. Recognition and reaction of metallointercalators with DNA. Chem. Rev. 1999， 99， 2777-2796.

[2]Friedman， A. E.; Chambron， J. C.; Sauvage， J. P.; Turro， N. J.; Barton， J. K.A molecular light switch for DNA： Ru（bpy）2（dppz）2+. J. Am. Chem. Soc. 1990， 112， 4960-4962.

[3]Puckett， C. A.; Ernst， R. J.; Barton， J. K. Exploring the cellular accumulation of metal complexes. Dalton Trans. 2010， 39， 1159-1170.

[4]Brandenburg B.; Zhuang， X. W. Virus trafficking-learning from single-virus tracking. Nature Reviews Microbiology. 2007， 5， 197-208.

[5]Cook， N. P.; Torres， V.; Jain， D. Martí， A. A.Sensing amyloid-β aggregation using luminescent dipyridophenazine ruthenium（II） complexes. J. Am. Chem. Soc. 2011， 133， 11121-11123.

[6]Novakova， O.; Kasparkova， J.; Vrana， O.Correlation between Cytotoxicity and DNA Binding of Polypyridyl Ruthenium Complexes. Biochem. 1995， 34， 12369-12378.

[7]Kelly J. M.; Tossi， A. B.; McConnell， D. J. A study of the interactions of some polypyridylruthenium（II） complexes with DNA using fluorescence spectroscopy， topoisomerisation and thermal denaturation. Nucleic Acids Res. 1985， 13， 6017-6034.

[8]Liang， Q.; Eason， P. D.; Long. E. C. Metallopeptide-DNA Interactions： Site-Selectivity Based on Amino Acid Composition and Chirality. J. Am. Chem. Soc. 1995， 117， 9625-9631.

[9]Franklin， C.A.; Fry J. V.; Collins， J. G. Comparative Analysis of [Au（en）2]3+ and [Pt（en）2]2+ non Covalent Binding to Calf Thymus DNA. Inorg. Chem. 1996， 35， 7541-7545.

[10]Metcalfe， C.; Thomas， J. A. Kinetically inert transition metal complexes that reversibly bind to DNA.Chem. Soc. Rev. 2003， 32， 215-224.

[11]Ji， L. N.; Zou， X. H.; Liu， J. G. Shape-and enantioselective interaction of Ru（Ⅱ）/Co（Ⅲ） polypyridyl complexes with DNA. Coord. Chem. Rev. 2001， 216， 513-536.

[12]Lim， M. H.; Song， H.; Olmon， E. D. Sensitivity of Ru（bpy）2dppz2+Luminescence to DNA Defects. Inorg. Chem. 2009， 48， 5392-5397.

[13]Kumar， C.V.; Barton， J. K.; Turro， N. J.Interactions of polypyridyl cobalt complexes with DNA studied by rotating electrode methods. J. Am. Chem. Soc. 1985， 107， 5518-5523.

[14]Shi， S.; Geng， X. T.; Zhao， J.; Yao T. M.; Wang， C. R.; Yang， D.J.; Zheng， L. F.; Ji， L. G. Interaction of [Ru（bpy）2（dppz）]2+ with human telomeric DNA： Preferential binding to G-quadruplexes over i-motif. Biochimie. 2010， 92， 370-377.

[15]Shao， J. Y.; Sun， T.; Guo， Q. Y. In situ electrochemically tuned photoluminescence of [Ru（bpy）2（dppz）]2+aggregates with single-walled carbon nanotubes and DNA monitored by guanine oxidation. Transition Metal Chemistry. 2011， 36， 499-504.

[16]Liang， M. M.; Jia， S. P.; Zhu， S. C.Photoelectrochemical sensor for the rapid detection of in situ DNA damage induced by enzyme-catalyzed Fenton reaction.? Environmental Science & Technology. 2008， 42， 635-639.

[17]Rüba， E.; Hart， J. R.; Barton， J. K.[Ru（bpy）2（L）]Cl2： Luminescent Metal Complexes That Bind DNA Base Mismatches. Inorg. Chem. 2004， 43， 4570-4578

[18]Wong， E.; Giandomenico， C. M. Soluble Single-Walled Carbon Nanotubes as Longboat Delivery Systems for Platinum（IV） Anticancer Drug Design. Chem. Rev. 1999， 99， 2451-2466.

[19]O'Connor， M. B.; Killard， A. J.; O'Kennedy， R. J. Production and characterization of a polyclonal antibody for Os（II） and Ru（II） polypyridyl complexes. Inorg. Biochem. 2006， 100， 1252-1259.

[20]Hu， L. Z.; Bian， Z.; Li， H. J.; Han， S.; Yuan， Y. L.; Gao， L. X.; Xu， G. B. [Ru（bpy）2dppz]2+ electrochemiluminescence switch and its applications for DNA interaction study and label-free ATP aptasensor. Anal. Chem. 2009， 81， 9807-9811.

[21]Zhou， P.; Zheng， Z. H.; Lu， W. Multicolor Labeling of Living-Virus Particles in Live Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 2012， 51， 670-674.

[22]Amouyal， E.; Homsl， A.; Chambron， J. C.; Sauvage， J. P. ChemInform Abstract： Synthesis and Study of a Mixed-Ligand Ruthenium（II） Complex in Its Ground and Excited States： Bis（2，2-bipyridine）（dipyrido（3，2-a：2，3-c）phenazine-N4N5） ruthenium（II）. J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1990， 6， 1841-1845.

[23]Ackermann， M. N.; Interrante， L. V. Ruthenium（II） complexes of modified 1，10-phenanthrolines. 1. Synthesis and properties of complexes containing dipyridophenazines and a dicyanomethylene-substituted 1，10-phenanthroline. Inorg. Chem. 1984， 23， 3904-3911.

[24]Yang， X. R.; Xu， J.; Tang， X. M.; Liu， H. X.; Tian， D. B.A novel electrochemical DNAzyme sensor for the amplified detection of Pb2+ ions. Chem. Commum. 2010， 46， 3107-3109.

[25]Li， J.; Lu， Y. A Highly Sensitive and Selective Catalytic DNA Biosensor for Lead Ions. J. Am. Chem. Soc. 2000， 122， 10466-10467.

[26]Lu， Y. New Transition-Metal-Dependent DNAzymes as Efficient Endonucleases and as Selective Metal Biosensors.Chem.Eur. J. 2002，8，4588-4596.