王文莉，魏楠楠，徐守興，盧炳洲，張大俊，張克山，鄭海學(xué)，劉湘濤

（1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046）

羊口瘡（Orf），又名羊傳染性膿皰、羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎[1-2]，是由痘病毒科、脊椎動(dòng)物痘病毒亞科、副痘病毒屬的典型代表羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）[3-4]引起的，主要通過(guò)破損的皮膚及黏膜感染，引起的綿羊、山羊以及人的一種急性高度接觸性人獸共患傳染病，也會(huì)感染其他野生反芻動(dòng)物如鹿、麝牛等。臨床表現(xiàn)以口、舌、鼻、唇、乳房等部位的皮膚和黏膜形成水皰、膿皰、潰瘍和結(jié)痂為特征，主要引起皮膚和黏膜的增生性病變[5-7]。嚴(yán)重影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至引起繼發(fā)性感染，病死率可達(dá)20%～50%。ORFV在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)嚴(yán)重威脅著人類的健康。

研究表明，羊口瘡病毒基因組為線性雙鏈DNA，大小為130～150 kb，中央編碼（ORFVs009-111）較為保守。Orf059（F1L）基因是ORFV基因組的第59個(gè)開(kāi)放閱讀框，位于基因中部高度保守的區(qū)域，編碼產(chǎn)生的39 kDa蛋白是病毒表面微管的組成成分之一，并且能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體[8]。該蛋白具有肝素結(jié)合活性，能夠與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面表達(dá)的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）受體結(jié)合，認(rèn)為該蛋白在病毒的吸附和侵入過(guò)程中起著重要作用[9]。同時(shí)該蛋白還是ORFV囊膜蛋白的重要組成成分，是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要抗原蛋白之一，能夠介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫[10]。因此研究F1L蛋白對(duì)羊口瘡的診斷和免疫具有重要意義。

目前，用于防控ORFV疫苗是弱毒疫苗。疫苗株和野毒株的F1L基因差異尚不清楚，本研究擴(kuò)增并測(cè)定了野毒株與疫苗株ORFV的F1L基因序列，并對(duì)不同毒株間的F1L的核苷酸序列、推導(dǎo)的氨基酸序列以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。該研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究ORFV的分子機(jī)制提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源疑似感染口瘡病毒的羊唇部痂皮、病料由某羊場(chǎng)提供。

1.2 材料疫苗、DNA提取試劑盒、ExTaqDNA聚合酶以及dNTP采購(gòu)自TaKaRa公司，引物由金唯智生物公司合成。

1.3 引物的設(shè)計(jì)合成根據(jù)GenBank中公布的F1L基因序列（GenBank登錄號(hào)：KP339950.1）并參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物P1：5'-ATGGATCCACCCGAAATCAC- 3'；下游引物P2：5'-TCACACGATGGCCGTGACCA- 3'。

1.4 病毒DNA的提取及PCR的擴(kuò)增按照DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行DNA的提取，并于-20℃保存。反應(yīng)體系（50 μL）：5×PCR buffer 10 μL，premerstar 酶0.5 μL，模板1 μL，P1/P2（10 pm/L）各1μL，dNTP 5μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，56.5℃退火50 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 序列測(cè)定及其分析將電泳檢測(cè)片段大小合適的擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序。利用DNAStar、DNAMAN等軟件進(jìn)行疫苗株和分離株序列的比對(duì)，分析F1L基因在核苷酸和氨基酸水平上的變異情況；將測(cè)定后的序列與GenBank上已公布的F1L基因序列進(jìn)行比對(duì)分析；采用在線工具對(duì)測(cè)定的疫苗株及分離株F1L基因序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并分別對(duì)F1L基因編碼的蛋白質(zhì)一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。

1.6 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的比較分析運(yùn)用Expasy在線工具包中的ProtParam分析ORFV疫苗株和野毒株編碼的F1L蛋白的氨基酸組成及各種理化性質(zhì)；利用DNAStar軟件的Kyte Doolittle 方法預(yù)測(cè)其親水性及疏水性；利用TMHMM 2.0和Expasy中的Signal IP分析工具預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)以及信號(hào)肽。

1.7 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的比較分析用DNAStar軟件對(duì)疫苗株和分離株的F1L蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。依據(jù)其親水性、表面可能性分析以及抗原指數(shù)分析結(jié)果預(yù)測(cè)其可能的抗原表位。

1.8 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析將疫苗株與分離株的F1L基因推導(dǎo)的氨基酸序列提交到Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，并用Swiss-PDB-Viewer軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 F1L基因的擴(kuò)增應(yīng)用F1L基因特異性引物，以提取的病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)了1條約1000 bp DNA片段，與預(yù)期大小相一致。

2.2 序列測(cè)定和分析用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序所得的疫苗株和分離株F1L基因核苷酸序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示：兩者的核苷酸序列同源性為95.9%，共發(fā)現(xiàn)42處變異。運(yùn)用BLAST軟件，將2個(gè)序列與GenBank上同屬的其他毒株進(jìn)行核苷酸序列同源性比較（表1），發(fā)現(xiàn)本次測(cè)定的ORFV疫苗株、分離株F1L基因的核苷酸序列和氨基酸序列與其他毒株的相似性分別為96.4%～97.5%，97.8%～99.1%。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，本次測(cè)定的ORFV分離株F1L基因核苷酸與2015年公布的毒株KP339950.1同源性最高，同時(shí)與毒株KP339949.1以及KX029229.1較為接近，處在同一進(jìn)化分支上（圖1）。

表1 ORFV分離株F1L基因核苷酸和氨基酸同源性分析Table 1 Nucleotide sequence homology and amino acid sequence homology analysis of F1L gene of ORFV isolates

圖1 ORFV不同毒株編碼的F1L基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of F1L gene of ORFV isolates

2.3 蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能分析

2.3.1 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析 將疫苗株和分離株推導(dǎo)的氨基酸序列提交在線工具Expasy，可知疫苗株和分離株F1L蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為37266.40和37574.86 Da，理論等電點(diǎn)分別為5.67和5.68。疫苗株編碼的F1L蛋白因突變后酪氨酸殘基減少，摩爾消光系數(shù)減少。疫苗株與分離株F1L蛋白均為疏水性不穩(wěn)定蛋白，平均親水性指數(shù)分別為0.073和0.111，不穩(wěn)定指數(shù)分別為48.82和46.85。利用TMHMM 2.0分析可知，疫苗株和分離株F1L蛋白均在282～304和311～333共有2個(gè)跨膜區(qū)（圖2）。SignalP 4.1分析表明疫苗株和分離株F1L蛋白都無(wú)信號(hào)肽。

圖2 F1L蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of transmembrane region of F1L protein

2.3.2 蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能分析 運(yùn)用DNAStar軟件預(yù)測(cè)疫苗株和分離株的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3），結(jié)果顯示兩者蛋白形成的α螺旋和β折疊較多，這可能與該蛋白的氨基酸組成有關(guān)。其中疫苗株比分離株多1個(gè)α螺旋，多3個(gè)β折疊。疫苗株F1L蛋白在3～17 aa區(qū)段為β折疊，而分離株在該區(qū)段3～8 aa區(qū)段為α螺旋，8～15 aa區(qū)段為β折疊。將推導(dǎo)的疫苗株與野毒株F1L蛋白序列提交到Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)（圖4），可以看出疫苗株和野毒株F1L蛋白的三維結(jié)構(gòu)有明顯差異，分離株在130～180 aa、230～270 aa區(qū)段比疫苗株多了無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域。

圖3 ORFV疫苗株（上圖）與分離株（下圖）F1L蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Secondary structure prediction of ORFV vaccine strain (the figure above) and isolated type strain (the following figure) F1L protein

3 討論

羊口瘡是一種高度接觸性急性人獸共患病，傳播范圍廣，該病常為群體發(fā)病，尤其是密集的羊群。給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也直接威脅著人類健康[11]。近幾年來(lái)ORFV感染的宿主范圍在逐漸擴(kuò)大，除了感染小反芻獸外，馴鹿、麝牛等也可感染。目前該病的發(fā)病率及感染程度均較以往有所增強(qiáng)。

圖4 ORFV疫苗株（A）和分離株（B） F1L 蛋白結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.4 Three-dimensional structure prediction of ORFV vaccine strain (A) and isolated strain (B) F1L protein

疫苗接種為有效控制該病發(fā)生的手段。弱毒苗是國(guó)內(nèi)外進(jìn)行常規(guī)免疫的首選。在一定程度上這些疫苗能有效的降低感染率。然而，近年來(lái)有研究報(bào)道弱毒疫苗免疫后，不能提供有效的保護(hù)，出現(xiàn)免疫失敗和重復(fù)感染[12]。

本研究以疫苗株和分離株病毒提取到的基因組DNA為模板擴(kuò)增F1L基因，測(cè)序后對(duì)比分析二者的結(jié)構(gòu)和序列。發(fā)現(xiàn)疫苗株和分離株F1L基因在核酸水平和蛋白水平均存在一定的差異。疫苗株和分離株F1L基因在同一區(qū)段有2個(gè)跨膜區(qū)，親水性區(qū)域相同且都無(wú)信號(hào)肽，但二者的理論等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量不同。預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中疫苗株比分離株多1個(gè)α螺旋，多3個(gè)β折疊，可能 B細(xì)胞表位也有差異。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋、β折疊的鍵能較高，能牢固的維持蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，但很難較好的與抗體嵌合，并經(jīng)常位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，因而很少成為抗原表位。預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)在N末端有明顯的區(qū)別，應(yīng)該是一、二級(jí)結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致三級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。

F1L蛋白是ORFV重要的保護(hù)性抗原蛋白，具有良好的免疫原性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。F1L基因的序列遺傳進(jìn)化分析能夠?yàn)镺RFV的流行病學(xué)研究提供一定的參考。對(duì)F1L基因及其編碼蛋白的研究有助于闡明ORFV的致病機(jī)制，并且也為羊口瘡的有效防控措施的制定提供重要的理論依據(jù)。

本研究通過(guò)對(duì)ORFV疫苗株與分離株F1L基因進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)他們?cè)谝弧⒍?、三?jí)結(jié)構(gòu)存在差異。該研究結(jié)果為F1L蛋白功能研究提供了線索，同時(shí)也為ORFV弱毒活疫苗致弱機(jī)制是否與該基因的變化有關(guān)提供了研究切入點(diǎn)和可能性。