岳會(huì)珠 王桂菊 齊紅雙 許 麗

乳腺癌是1類具有較強(qiáng)家族遺傳性的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率處于高位，最新的生物分子學(xué)研究[1]發(fā)現(xiàn)血清分子標(biāo)記物對(duì)乳腺癌的診斷、治療和預(yù)后等多方面都可發(fā)揮顯著的作用。

微小RNA(Minimal RNA，miRNA)是1種非編碼單鏈小分子RNA，對(duì)某些mRNA具有特異性識(shí)別功能，轉(zhuǎn)錄后對(duì)mRNA的翻譯過(guò)程產(chǎn)生抑制，進(jìn)而調(diào)控某些靶基因，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等多種生命活動(dòng)過(guò)程的作用。研究[2]證實(shí)miRNA的表達(dá)失調(diào)或功能失調(diào)在多種疾病特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程均發(fā)揮著重要作用，其根據(jù)腫瘤的具體發(fā)病部位而發(fā)揮調(diào)節(jié)致癌或抑癌基因的作用。miR-34a是1類具有高度保守的miRNA，在多種惡性腫瘤組織存在低表達(dá)量，被認(rèn)為是具有重要潛力的血清分子標(biāo)記物，但關(guān)于乳腺癌的研究較少[3]。因而，本研究深入探討了外周血中miR-34a在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院病理科收集的乳腺癌組織標(biāo)本80例(癌組織)、40例癌旁組織標(biāo)本(癌旁組織)，收集時(shí)間2010年1月至2014年10月。乳腺癌患者年齡35～62歲，平均(53.4±8.8)歲，病灶最大徑≥3 cm 45例、<3 cm 35例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期26例、Ⅲ期34例；腫瘤類型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌23例、非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌57例。癌旁組患者，年齡37～64歲，平均(52.0±9.3)歲，兩組研究對(duì)象的年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)[4]①乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社《外科學(xué)》第八版中的標(biāo)準(zhǔn)；②患者年齡19～65歲；③標(biāo)本均來(lái)源于手術(shù)后切除標(biāo)本；④患者手術(shù)前無(wú)放化療史、免疫治療史；⑤本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①轉(zhuǎn)移性乳腺癌；②術(shù)后復(fù)發(fā)患者；③具有放化療病史；④未經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。

1.3 RT-PCR法

應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩組標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平，具體方法如下：Trizol法提取乳腺癌組織和癌旁組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄法對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并合成cDNA，試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。SYBR Green法進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為15 s預(yù)變性，95 ℃；30 s 60 ℃；10 s 72 ℃，反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)并設(shè)3復(fù)孔對(duì)照[5]。

1.4 原位雜交方法技術(shù)

利用本室構(gòu)建NOEY2真核表達(dá)質(zhì)料NOYE-CR為模板，酶切后體外轉(zhuǎn)錄制備RNA探針，長(zhǎng)約750 bp；NOEY2正義探針為陰性對(duì)照，GAPDH探針檢測(cè)相同組織為陽(yáng)性對(duì)照[6]。

原位雜交后評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無(wú)色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色。當(dāng)評(píng)分<2分定義為miR-34a低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平比較

乳腺癌組織中的miR-34a表達(dá)水平顯著的低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平比較

2.2 乳腺癌標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平與其臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

乳腺癌組織中的miR-34a表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性(P<0.05)；乳腺癌組織中的miR-34a表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤類型、ER表達(dá)、PR表達(dá)無(wú)顯著關(guān)系(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 miR-34a表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系(例，%)

2.3 乳腺癌中miR-34a表達(dá)與其預(yù)后的關(guān)系

低表達(dá)miR-34a乳腺癌患者隨訪60個(gè)月生存21例(46.67%)、失訪3例，高表達(dá)miR-34a乳腺癌患者生存20例(64.52%)、失訪1例，兩組生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.354，P=0.125>0.05)。

低表達(dá)miR-34a乳腺癌患者生存時(shí)間短于高表達(dá)miR-34a乳腺癌患者[Log Rank(Mantel-Cox) =3.928，P=0.047<0.05)](圖1)。

圖1 乳腺癌中miR-34a表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。女性乳腺是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的，乳腺癌中99%發(fā)生在女性，男性僅占1%[7]。流行病學(xué)研究[8]統(tǒng)計(jì)，乳腺癌已經(jīng)成為女性健康問(wèn)題的第一大危害，特別是城市白領(lǐng)，是這一疾病的高危人群。乳腺癌的病因尚未完全清楚，研究[9]發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)病存在一定的規(guī)律性，具有乳腺癌高危因素的女性容易患乳腺癌。目前，化療藥物的治療和乳腺切除術(shù)是治療乳腺癌晚期的重要手段，其中化療是針對(duì)浸潤(rùn)擴(kuò)散型乳腺癌的治療最佳方法，但會(huì)誘發(fā)腎功能損傷、胃腸道反應(yīng)和神經(jīng)毒性等嚴(yán)重不良反應(yīng)[10]。故而，探尋預(yù)估患者的化療療效和預(yù)后已成為臨床研究的重要方向。

miRNA是最近幾年發(fā)現(xiàn)的可調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的小分子RNA，對(duì)某些基因的位點(diǎn)可發(fā)揮靶向作用進(jìn)而抑制腫瘤RNA的翻譯過(guò)程，研究[11]也證實(shí)乳腺癌與miRNA的遷移過(guò)程和病理發(fā)展過(guò)程關(guān)系密切，利用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)乳腺癌組織中的miRNA的表達(dá)情況，并與正常乳腺組織進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中存在多種miRNA的異常表達(dá)，其中miR-155、miR-29c、miR-365等均出現(xiàn)過(guò)表達(dá)情況，但miR-31、miR-127和miR-497均存在弱表達(dá)，該結(jié)果也提示我們不同的miRNA在乳腺癌的表達(dá)情況和發(fā)揮的作用也不盡相同。miR-34a是最近發(fā)現(xiàn)的一類miRNA，其在多類腫瘤中均存在表達(dá)水平的顯著下降并認(rèn)為miR-34a可能具有抑制癌基因的重要保護(hù)功能，但現(xiàn)階段關(guān)于乳腺癌和miR-34a的研究較少。因而，本研究深入探討了外周血中miR-34a在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義。

本研究結(jié)果顯示乳腺癌組織中的miR-34a表達(dá)水平顯著的低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明miR-34a可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，進(jìn)而發(fā)揮抑制癌基因的作用。乳腺癌標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系結(jié)果顯示乳腺癌組織中的miR-34a表達(dá)水平與患者的TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性(P<0.05)。該結(jié)果說(shuō)明mir-30a具有抑制乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)的作用。miRNAs主要通過(guò)抑制靶基因的特殊位點(diǎn)降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯，進(jìn)而對(duì)靶基因負(fù)性調(diào)控，發(fā)揮腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)的作用[12]。

乳腺癌組織中的miR-34a表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤類型、ER表達(dá)、PR表達(dá)的情況無(wú)顯著關(guān)系(P>0.05)；低表達(dá)miR-34a乳腺癌患者隨訪60個(gè)月生存21例(46.67%)、失訪3例，高表達(dá)miR-34a乳腺癌患者生存20例(64.52%)、失訪1例，兩組生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.125>0.05)。但低表達(dá)miR-34a乳腺癌患者生存時(shí)間低于高表達(dá)miR-34a乳腺癌患者(P=0.047<0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明miR-30a的表達(dá)異?？勺鳛槿橄侔╊A(yù)后情況的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，并預(yù)測(cè)miR-34a可稱為乳腺癌治療的治療靶點(diǎn)之一。

現(xiàn)階段關(guān)于miR-30a在腫瘤組織的具體作用機(jī)制尚未得到完全解釋，張展[13]通過(guò)研究〗發(fā)現(xiàn)miR-30a可靶向整合抑制乳腺癌細(xì)胞的MDA-MB-435s和MCF-7的體外遷移、黏附和侵襲；程孟文[14]研究顯示miR-30a可作為作為細(xì)胞自噬抑制劑而抑制ATG5和BECN1的表達(dá)情況促進(jìn)化療引發(fā)的細(xì)胞毒性應(yīng)答作用。上述的研究均證實(shí)miR-30具有成為抑癌基因的潛力，并可成為1類特異性標(biāo)志物對(duì)腫瘤的侵襲潛能和轉(zhuǎn)移狀態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確反映，但關(guān)于miR-30a基因關(guān)于乳腺癌發(fā)展機(jī)制的研究和與是否具有與其他基因相互作用還需進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-34a低表達(dá)，并且與患者TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后有關(guān)。