6個稻瘟病抗性基因在浙江省主栽水稻品種中的分布和抗性評價

何海燕 邱海萍 柴榮耀 毛雪琴 王艷麗 孫國昌

摘 要：【目的】檢測浙江省40份水稻栽培品種和6份稻瘟病菌生理小種鑒別品種中6個抗性基因分布情況，同時鑒定品種苗瘟抗性水平，探討攜帶抗性基因和抗性水平相關(guān)性?！痉椒ā坷霉δ苄苑肿訕?biāo)記檢測品種中Pi1、Pi9/Piz、Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita，6個稻瘟病抗性基因的分布情況。用2015-2017年田間采集到的141個稻瘟菌菌株鑒定46個水稻品種苗瘟抗性水平?！窘Y(jié)果】6個抗性基因在浙江省栽培品種中分布頻率不同，其中Pita基因分布最廣，占47.83%;其次是Pikh，占41.30%;抗性基因Pi2/Pizt 和Pikm在栽培品種中分布頻率相等，均為34.78%;抗性基因Pi9/Piz在栽培品種中分布較少，僅有21.74%;抗性基因Pi1僅在稻瘟病菌生理小種鑒別品種TTP中檢測到?？剐运借b定結(jié)果顯示22個品種的抗性頻率在60%以上，兩個品種的抗性頻率達(dá)到80%以上?！窘Y(jié)論】浙江40份水稻栽培品種和6份稻瘟病菌生理小種鑒別品種攜帶抗性基因和其抗性水平部分相關(guān)。

關(guān)鍵詞：水稻;苗瘟;分子標(biāo)記;抗病基因

中圖分類號：S 435.111.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）02-214-09

0 引言

【研究意義】由子囊菌Magnaporthe grisea引起的稻瘟病是水稻三大病害之一，稻瘟病的爆發(fā)嚴(yán)重影響稻米的產(chǎn)量及品質(zhì)。20世紀(jì)70年代，稻瘟病是浙江省晚稻主要病害，流行年份發(fā)病面積約占栽培面積的20%～30%，2014年浙江省晚稻稻瘟病在杭嘉湖、寧紹平原等地突發(fā)流行，發(fā)病面積達(dá)到2.25萬hm2，浙粳88、中浙優(yōu)1號等推廣品種發(fā)病嚴(yán)重[1-2]。其原因在于帶有某些稻瘟病主效抗性基因的推廣品種在多年種植后抗性逐步喪失，并且品種區(qū)域布局過于單一化、集中化;在不利天氣因素的影響下，田間病菌爆發(fā)，導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。

培育品質(zhì)良好的抗性品種是水稻育種家孜孜以求的目標(biāo)，傳統(tǒng)育種主要通過田間雜交和回交，再結(jié)合田間抗性鑒定和農(nóng)藝性狀的綜合選擇，經(jīng)過多年多代篩選，選育抗性品種，這需要育種家有豐富的實踐經(jīng)驗[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Andersen等[4]于2003年提出了基因功能標(biāo)記（Functional markers，F(xiàn)Ms）的概念，指一個分子標(biāo)記位點代表一個特定的等位基因，通過對分子標(biāo)記的篩選即能對性狀進(jìn)行篩選。目前，育種家將分子標(biāo)記結(jié)合到傳統(tǒng)育種技術(shù)中，旨在實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、系統(tǒng)地鑒定水稻品種抗瘟基因型，達(dá)到培育抗性強(qiáng)及抗譜廣的水稻品種的目的。一些已經(jīng)被定位或克隆的抗性基因，比如Pi9、Pigm、Pita、Pikm等已經(jīng)在生產(chǎn)上廣泛運用[5-8]。范方軍等[9]利用水稻稻瘟病抗性基因Pi-b、Pita等4個基因的功能標(biāo)記檢測江蘇省64份水稻品系，結(jié)合穗頸瘟抗性鑒定，解析4個稻瘟病抗性基因在江蘇省粳稻稻瘟病抗性育種中的作用。宋兆強(qiáng)等[10]利用Pita、Pib等4個基因的功能標(biāo)記，對在稻瘟病菌圃經(jīng)多年抗性篩選的60份資源材料進(jìn)行基因型鑒定，并進(jìn)行抗性基因與穗頸瘟發(fā)病相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)所有基因的抗病能力都在不斷減弱。

【本研究切入點】了解品種本身抗病基因型，可以避免育種上抗病基因利用的盲目性。由此，本研究利用Pi1、Pi9/Piz、Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita 6個稻瘟病抗性基因功能性分子標(biāo)記，對浙江省46個水稻栽培品種和稻瘟病菌生理小種鑒別品種，包括秈型三系雜交稻、粳型三系雜交稻、秈型兩系雜交稻、粳型常規(guī)稻、秈型常規(guī)稻等進(jìn)行了抗瘟基因型檢測，并且對這些品種進(jìn)行了稻瘟菌苗期接種、抗苗瘟水平分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在明確浙江省水稻栽培品種的基因型，初步探討水稻基因型和抗瘟水平的相關(guān)性，為浙江省稻區(qū)抗病品種的合理布局提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料及種植條件

供試水稻品種包括陽性對照材料麗江新團(tuán)黑谷單基因系品種8個，為Pi1、Pi9、Piz、 Pi2、 Pizt、 Pikh、 Pikm、Pita基因供體品種IRBL1-CL、IRBL9-W、IRBLz-Fu、IRBLZ5-CA、IRBLZt-T、IRBLkh-k3、IRBLkm-Ts和IRBLta-K1，由糧食作物“基因?qū)颉辈『r(nóng)業(yè)部行業(yè)專項提供。陰性感病對照材料麗江新團(tuán)黑谷1份，浙江省水稻栽培品種 40份，稻瘟病菌生理小種鑒別品種6份;由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物與微生物研究所提供。

將水稻種子置于 28℃培養(yǎng)箱浸種 2 d，32℃催芽 48 h，選取發(fā)芽良好的種子穴播于盛有肥沃土壤的育苗盆內(nèi)，穴間距為 5 cm 左右，每穴播種發(fā)芽良好的種子10粒左右，每盆中分別設(shè)感病對照 1 份，各重復(fù)內(nèi)品種采用隨機(jī)排列;2 葉期定苗酌施氮肥，促苗以利于做接種試驗。在溫室中培養(yǎng) 14 d 后，進(jìn)行樣品采集和接種。

1.2 病原菌材料、培養(yǎng)及接種調(diào)查

1.2.1 菌株來源、活化、繁殖和產(chǎn)孢 供試菌株為2016-29-2、2017-58-1、2016-42-1等141個菌株（由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所提供），所有菌株為2015-2017年間分離自浙江各地采集的稻瘟菌標(biāo)樣。菌株在PDA平板上活化后，接種于燕麥固體培養(yǎng)基上， 26℃下 12 h 光暗交替培養(yǎng) 10 d。加入適量無菌水刷洗培養(yǎng)基里的孢子，雙層紗布過濾后，觀察稻瘟病菌產(chǎn)孢情況，用血球計數(shù)板將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至約 2× 105個·mL-1，作為苗期噴霧的接種體。

1.2.2 水稻葉片噴霧接種和發(fā)病調(diào)查 待水稻生長 14 d 左右，即在幼苗三葉一心期，在懸浮液中加入 0.5%～0.8%的 Tween20 進(jìn)行噴霧接種，每 100 株苗約噴 20mL（以菌株薄霧均勻沾布全部葉片為度）;于 26～28℃下黑暗保濕（相對濕度約95%） 24 h，然后將育苗盤移至 28℃的高濕（用噴霧器進(jìn)行不定時噴霧）環(huán)境下培育。

在水稻接種 7 d 左右進(jìn)行調(diào)查：以感病對照品種發(fā)病程度判斷試驗的有效性。以病斑是否典型，大小及數(shù)量記載病情。本試驗中麗江新團(tuán)黑谷單基因系和浙江省栽培品種的抗瘟性等級，以水稻苗期調(diào)查9級分級標(biāo)準(zhǔn)[11]。0級，沒有癥狀，免疫;1級，針頭狀大小褐色小點，高抗;2級，直徑≤1 mm的褐色病斑，抗病;3級，灰色病斑，邊緣褐色，病斑直徑約1～2 mm，中抗;4級，典型紡錘形病斑，長3 mm以上，通常在兩條葉脈之間，為害面積不超過葉面積2%，中感;5～7級，典型病斑，為害面積占葉面積10%～50%，感病;8～9級，典型病斑，為害面積51%以上，高感。抗性頻率（%）為水稻材料在稻瘟菌接種中表現(xiàn)抗性菌株數(shù)與總測定菌株數(shù)目之比。1.3 樣品采集及DNA提取

每個品種采集1個單株的2 cm長葉片，置于2 mL離心管（提前放置2～3顆鋼珠）中，經(jīng)液氮速凍后，置于-80℃的冰箱里儲藏備用。

用TPS法抽提水稻葉片總DNA。在每個放置樣品的離心管中加入800 μL的TPS（100 mmol·L -1 Tris-Cl，pH值8.0;10 mmol·L -1 EDTA，pH 值8.0;1 mol·L -1 KCl）抽提液。將離心管放入組織研磨儀，70 Hz、90 s研磨2次。 將磨碎的葉片放入65℃水浴中溫浴30 min。12 000 r·min-1離心10 min。 取上清液于1.5 mL的離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），混勻，12 000 r·min-1離心5 min。取上清加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10 min， 12 000 r·min-1離心5 min。棄上清，加入800 μL 75%乙醇，洗滌沉淀，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，控干殘液，室溫（37℃）放置使沉淀干燥，加入100 μL ddH2O（含RNA酶）溶解，37℃溫浴40 min，然后-20℃保存。

1.4 ?Pi1、Pi9/Piz、Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita等6個基因特異性分子標(biāo)記與檢測

1.4.1 Pi1、Pi9/Piz、Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita等6個基因特異性分子標(biāo)記

本研究檢測Pi1 [12-13]、Pi9/Piz[14-15]、Pi2/Pizt[15-16]、Pikh[17-18]、Pikm[19-20]、Pita[21-22]6個稻瘟病抗性基因，其特異性分子標(biāo)記的引物信息見表1。引物由上海擎科生物技術(shù)公司合成。

1.4.2 Pi1、Pi9/Piz、Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita 等6個基因特異性分子標(biāo)記的檢測

采用PCR擴(kuò)增方法檢測。用20 μL PCR反應(yīng)體系，含1 μL（40 ng）Template DNA，0.5 μLForward Primer（10 μm）， 0.5 μL Reverse Primer（10 μm），10 μL ?2×TSINGKE Master Mix，8 μL ddH2O。 PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min;然后94℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸1 kb·min-1，將這三步進(jìn)行35個循環(huán);最后72℃ 5 min。制備 1.0%～2.5%的瓊脂糖凝膠，電壓 90～140V 下電泳15～45 min。最后，在紫外線凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照并記錄試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試栽培品種、稻瘟病菌生理小種鑒別品種和麗江新團(tuán)黑谷單基因系的抗性頻率

本研究利用田間收集的141個稻瘟病菌對40個浙江省栽培品種、6個稻瘟病菌生理小種鑒別品種，以及8個含有對應(yīng)抗性基因的麗江新團(tuán)黑谷單基因系進(jìn)行了苗期抗性測定。結(jié)果顯示，在 40個浙江省水稻栽培品種中，有2個水稻品種抗性頻率達(dá)到80%以上，分別為秀水321和浙優(yōu)12;有 13個品種抗性頻率在70%～80%，分別為Y兩優(yōu)1號、春優(yōu)84、浙粳86、深兩優(yōu)5814、浙粳99、甬優(yōu)12、甬優(yōu)538、中浙優(yōu)8號、浙粳70、秀水519、秀水134、寧88、甬優(yōu)1540;有 6個品種抗病頻率在60%～70%，分別為Y兩優(yōu)689、嘉58、內(nèi)五優(yōu)8015、錢優(yōu)0508、寧84、春優(yōu)927。6個稻瘟病鑒別品種中，抗性頻率最高的是TTP，為54.61%;抗性頻率最低的是合江18，為26.95%。8個麗江黑谷單基因系中，抗性頻率最高的是IRBL9-W（Pi9）和IRBLZ5-CA（Pi2），分別為60.99%和58.87%，說明Pi9和Pi2基因的抗譜較廣，同前人研究吻合?？剐灶l率最低的是IRBLta-K1（Pita）和IRBLzt-T（Pizt），均為17.73%，其余幾個單基因系的抗性頻率在30%～45%。鑒定結(jié)果如表2所示。

2.2 供試栽培品種和稻瘟病菌生理小種鑒別品種的抗瘟基因型及其分布

利用已建立的分子鑒別體系對 40個浙江省水稻栽培品種和6個稻瘟病鑒別品種的基因分布情況進(jìn)行了研究，獲得了部分稻瘟病抗性基因的分布情況（表3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這 46個品種中，有1個品種攜帶 Pi1抗病基因，為稻瘟病菌生理小種鑒別品種TTP。有10個品種（其中兩個為稻瘟病菌生理小種鑒別品種）攜帶Pi9/Piz 抗病基因，其中9個為純合基因型，1個為雜合型。有16個栽培品種攜帶 Pi2/Pizt 抗病基因，其中13個為純合基因型，3個為雜合基因型。有19個品種（其中2個為稻瘟病菌生理小種鑒別品種）攜帶 Pikh 抗病基因，其中10個為純合基因型，9個為雜合基因型。有16個品種（其中2個為稻瘟病菌生理小種鑒別品種）攜帶 Pikm 抗病基因，有22個品種（其中1個為稻瘟病菌生理小種鑒別品種）攜帶 Pita抗病基因，其中10個為純合基因型，12個為雜合基因型。在檢測的水稻品種中，抗性基因Pita和Pikh分布頻率最高，分別為47.83%和41.30%;其次是抗性基因Pikm和Pi2/Pizt，分別為39.13%和34.78%; Pi9/Piz和Pi1分布頻率為21.74%和2.17%。部分品種分子標(biāo)記檢測結(jié)果如圖1所示，各個抗性基因分布頻率如圖2所示。

2.3 供試品種抗瘟基因數(shù)量分析

對40個浙江省水稻栽培品種和6個稻瘟病菌生理小種鑒別品種檢出的稻瘟病抗性基因進(jìn)行數(shù)量分析，春優(yōu)84、浙粳70兩個栽培品種同時攜帶4個抗性基因，占檢測品種比率為4.35%;寧81、浙粳86、紹糯9714、秀水12號等15個品種（其中2個為稻瘟病菌生理小種鑒別品種）同時攜帶3個抗病基因，占檢測品種比率為32.61%;Y兩優(yōu)689、嘉58和錢優(yōu)0508等13個栽培品種同時攜帶2個抗病基因，占測試品種的23.91%;有12個品種（其中1個為稻瘟病菌生理小種鑒別品種）僅攜帶1個抗病基因，占測試品種的26.09%;還有6個品種未攜帶任何抗病基因，其比率為13.04%。

2.4 檢出的抗瘟基因數(shù)量、類型與品種抗病性的相關(guān)性分析

為了探明浙江省栽培水稻品種和稻瘟菌檢測品種抗瘟基因類型或數(shù)量與品種抗病性之間的相關(guān)性，本研究對46個水稻品種進(jìn)行了稻瘟病苗葉瘟檢測，并用6個稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記對46個品種進(jìn)行了基因型檢測。結(jié)果表明，其中28個品種（占比為60.87%）含有2個或2個以上抗性基因，這28個品種中18個品種的抗性頻率高于60%，僅有1個品種抗性頻率低于50%，而含有對應(yīng)基因的8個麗江新團(tuán)黑谷單基因系中有6個抗性頻率在45%以下，說明聚合了2個或2個以上抗性基因的材料抗性頻率明顯提高。隨著品種中檢出的抗性基因數(shù)量增多，品種的抗性頻率也明顯上升。含有4個抗病基因的2個品種，抗性頻率都超過70%;在含有3個抗病基因的15個品種中，14個品種抗性頻率都在50%以上。春優(yōu)84聚合了Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita 4個抗病基因，其中3個為雜合基因型，抗性頻率達(dá)76.60%;浙粳86、寧88和甬優(yōu)1540聚合了Pi2/Pizt、Pikh、Pita等3個抗性基因，抗性頻率分別達(dá)79.43%、79.43%和78.01%; 秀水321和浙粳99聚合了Pi2/Pizt、Pikm、Pita 等3個抗性基因， 其中2個為純合型，抗性頻率達(dá)81.56%和79.43%。說明抗性頻率高的品種基本都聚合了多個抗性位點的多個抗性基因。同時沒有聚合Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita 其4個抗性位點中3個位點，抗性頻率卻低于70%的品種，說明Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita等4個抗病基因在浙江省栽培品種中起到了主要的抗性效用。

3 討論與結(jié)論

了解水稻品種稻瘟病抗病基因的數(shù)量和構(gòu)成情況是利用抗病品種應(yīng)對稻瘟病的基礎(chǔ)。新團(tuán)麗江黑谷單基因系的構(gòu)建、稻瘟病抗性基因的克隆和特異性分子標(biāo)記的開發(fā)為人們分析水稻品種中稻瘟病抗性基因提供了技術(shù)支持[13，15]。本研究以浙江省水稻栽培品種和稻瘟病菌生理小種鑒別品種為主要檢測對象，以期明確上述品種中Pi1、Pi9/Piz、Pi2/Pizt、Pikh、Pikm 和Pita這6個基因位點的分布情況，為本地區(qū)廣譜抗瘟品種的培育和各栽培品種的合理布局提供科學(xué)依據(jù)。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，同時攜帶Pi1和Pi2兩個抗性基因的水稻品種，對稻瘟病的抗性效果明顯好于單獨攜帶Pi1和Pi2基因的水稻品種，認(rèn)為這兩個基因存在互補(bǔ)關(guān)系[23-26]。于苗苗等[27]在2013年研究指出Pi1和Pi2聚合后不同遺傳背景的材料抗性頻率均達(dá)到90%以上。本研究中發(fā)現(xiàn)浙江省水稻栽培品種中有16個材料有Pi2/Pizt基因，然而攜帶Pi1基因的材料基本沒有，因此在今后的育種研究中可以考慮培育聚合Pi1和Pi2基因的品種，提高品種抗病性。

前人研究發(fā)現(xiàn)抗病鑒定結(jié)果與標(biāo)記篩選出抗性基因數(shù)量多寡之間有一定的差異，分析可能原因認(rèn)為目前已經(jīng)定位的抗性基因達(dá)到100個以上，而實驗中檢測的基因數(shù)量非常有限，并不能代表品種中實際含有的抗性基因情況[28]。比如品種深兩優(yōu)5814僅含有Pita 1個抗性基因，為雜合型，抗性頻率卻達(dá)到了71.63%;品種中浙優(yōu)8號沒有檢測到此6個抗性基因中的任何一個，抗病頻率卻達(dá)到73.05%。說明這2個品種中可能存在其他抗譜廣的抗性基因，值得進(jìn)一步研究利用。

本研究中使用的Pi9和Piz基因、Pi2和Pizt基因的抗感顯性分子標(biāo)記一致，然而分別攜帶Pi9和Piz基因的麗江新團(tuán)黑谷單基因系材料抗譜并不一致，分別攜帶Pi2和Pizt基因的麗江新團(tuán)黑谷單基因系材料抗譜也不一致，說明Pi9和Piz， Pi2和Pizt基因同源程度比較高，在進(jìn)化過程中分化比較晚，但是它們對水稻稻瘟病抗性水平有明顯不同。文中檢測到10個品種攜帶Pi9/Piz基因，然而它們的抗性頻率均不到60%（低于攜帶Pi9基因的麗江黑谷單基因系，其抗性頻率為60.99%，攜帶Piz基因的麗江黑谷單基因系，其抗性頻率為31.91%），可以推測這10個品種攜帶了Piz基因而非Pi9基因。 在今后的研究中可以進(jìn)一步開發(fā)能區(qū)分Pi2和Pizt基因、Pi9和Piz基因的特異性分子標(biāo)記，進(jìn)一步明確品種基因型，更有針對性地聚合相應(yīng)抗性基因的材料。

20世紀(jì)末有學(xué)者研究指出水稻稻瘟病防治面臨的挑戰(zhàn)在于稻瘟病菌的變異機(jī)制和品種抗性喪失機(jī)理并不明朗[29]。不同稻瘟菌在不同品種上寄生適合度存在差異，當(dāng)一個品種推廣種植數(shù)年后，常會引起病菌群體小種組成結(jié)構(gòu)的變化，繼而導(dǎo)致品種抗性喪失，培育稻瘟病抗性品種需要分析稻瘟病菌群體的地理分布和致病性分化[30-31];因此田間水稻品種的推廣應(yīng)當(dāng)注意合理布局，適時輪換，避免抗性品種的感病化，延長品種的使用年限。同時因品種中抗性基因分布情況是指導(dǎo)品種合理布局的基礎(chǔ)，因此今后仍有必要拓展不同類型抗瘟基因研究分析的深度和廣度，加大新的抗稻瘟病基因的利用，以及通過基因聚合等手段培育廣譜抗病品種。

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（責(zé)任編輯：林海清）