鮑魚內(nèi)臟多糖分離純化與抗氧化活性評價(jià)

陳勝軍 劉先進(jìn) 等

摘要：【目的】分離純化鮑魚內(nèi)臟多糖（Abalone viscera polysaccharide，AVP），并評價(jià)其抗氧化活性，為AVP的高值化利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳怎U魚內(nèi)臟為原料，采用酶法提取并初步純化出AVP，測定其DPPH自由基清除率、羥自由基（OH自由基）清除率和還原力3個(gè)抗氧化指標(biāo)，評價(jià)AVP抗氧化能力;同時(shí)用葡聚糖凝膠G-100柱層析分離AVP，并對分離出的組分進(jìn)行抗氧化能力比較。【結(jié)果】AVP質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率線性方程為y=9.715x+1.0182（R2=0.9958），半抑制濃度（IC50）為5.04 mg/mL;OH自由基清除率線性方程為y=6.2778x-8.5275（R2=0.9603），IC50為9.32 mg/mL;還原力線性方程為y=0.0782x+0.0045（R2=0.9989），A700，0.2為2.50 mg/mL。AVP具有一定的抗氧化能力，但與抗壞血酸（Vc）相比，其抗氧化能力較弱。AVP經(jīng)葡聚糖凝膠G-100柱層析可分離出兩個(gè)組分（AVP1和AVP2），AVP1和AVP2均具有一定的抗氧化活性，且AVP1抗氧化能力強(qiáng)于AVP2?！窘Y(jié)論】通過葡聚糖凝膠柱層析可從AVP中有效分離出AVP1和AVP2兩個(gè)組分，其中AVP1的抗氧化能力更強(qiáng)，在抗氧化添加劑及保健品等領(lǐng)域具有較好的開發(fā)利用前景。

關(guān)鍵詞： 鮑魚內(nèi)臟;分離純化;多糖;抗氧化

中圖分類號： S986.2;TS254.1? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）02-0372-06

Abstract：【Objective】Abalone viscera polysaccharide（AVP） was isolated and purified， then its antioxidant activity was evaluated. It provided technical support for high-value utilization of AVP. 【Method】In this research， the abalone viscera was used as experimental material to extract and purify AVP by enzymatic extraction and preliminary purification.The three antioxidant indexes， namely DPPH radical scavenging rate， hydroxyl radical（OH radical） scavenging rate and reducing power of AVP were determined， and the antioxidant capacity of AVP was evaluated. Meanwhile， the AVP was isolated by glucose gel G-100 column layer and the antioxidant abilities of isolated fractions were studied and compared. 【Result】The experimental results showed that the mass concentration of AVP was in the range of 1-10 mg/mL， and the linear equation of DPPH radical scavenging rate was y=9.715x+1.0182（R2=0.9958）， half-inhibitory concentration（IC50） value was 5.04 mg/mL. The linear equation of OH radical scavenging rate was y=6.2778x-8.5275（R2=0.9603）， IC50 value was 9.32 mg/mL. The linear equation of reducing power was y=0.0782x+0.0045（R2=0.9989）， and the value of A700，0.2 was 2.50 mg/mL. AVP could be separated into two components（AVP1 and AVP2） by G-100 column chromatography， both AVP1 and AVP2 had certain antioxidant activity， and AVP1 had higher antioxidant capacity than AVP2. 【Conclusion】AVP could be separated into AVP1 and AVP2 by sephadex column chromatography. AVP1 had higher antioxidant activity and therefore enjoys a good prospect of development and utilization in the fields of antioxidant additive and health products.

Key words： abalone viscera; separation and purification; polysaccharide; antioxidation

0 引言

【研究意義】鮑魚屬軟體動(dòng)物門（Mollusca）腹足綱（Gastropoda）前鰓亞綱（Prosobranchia）原始腹足目（Archaeogastropoda）鮑科（Haliotidae）鮑屬（Halio-tis）（李太武等，2004），其營養(yǎng)豐富、口感佳，具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者喜愛。然而，占鮑魚質(zhì)量五分之一的內(nèi)臟在加工過程中僅有少部分被制成鮑魚調(diào)味品等工藝產(chǎn)品（鄭瑞生等，2016），多數(shù)內(nèi)臟被當(dāng)作廢棄物直接丟棄，造成極大浪費(fèi)。鮑魚內(nèi)臟中富含多糖，王姣等（2015）通過木瓜蛋白酶與胰蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解提取，鮑魚內(nèi)臟多糖（Abalone viscera polysaccharide，AVP）提取率可達(dá)16.58%。隨著醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展與研究，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤、糖尿病、心臟病、腎病等近百種疾病的產(chǎn)生和發(fā)展都與氧化有關(guān)（凌關(guān)庭，2004）。由于人工合成的抗氧化劑具有損傷肝臟并誘發(fā)腫瘤等缺點(diǎn)（王蒞莎等，2008），因此，尋找高效安全的抗氧化劑具有重要意義，其中天然抗氧化劑因其安全、無毒、高效的特點(diǎn)而越來越受大眾的認(rèn)可（吳靜等，2016）。因此，研究AVP的抗氧化性，對提高鮑魚資源綜合利用率和鮑魚加工產(chǎn)品的附加值均具有重要意義，同時(shí)為研發(fā)天然抗氧化劑提供新途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】多糖作為一種高分子聚合物，在生物體內(nèi)具有豐富多樣的生物功能和活性作用，如調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖、降血脂等（Zhu et al.，2010，2011;Li et al.，2011;Wang et al.，2014;馬軍等，2017），已在食品和藥品中得到廣泛應(yīng)用。目前對鮑魚內(nèi)臟的生物活性功能研究已有不少報(bào)道。Sun等（2010）對AVP研究發(fā)現(xiàn)，40 mg/kg劑量的AVP在抗腫瘤和提供機(jī)體免疫能力上效果顯著;羅曉航（2012）通過高壓脈沖電場結(jié)合酶法提取了鮑魚臟器粗多糖，并發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化活性;余鑫（2012）對鮑魚臟器粗多糖的提取工藝和降血脂活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其對因高脂飲食所導(dǎo)致的小鼠血脂升高有顯著抑制作用;鄒文文（2013）通過Sevag法及DEAE-52纖維素陰離子交換層析對鮑魚臟器粗多糖進(jìn)行分離純化，得出3個(gè)組分，并發(fā)現(xiàn)這3個(gè)組分均具有一定的體外抗氧化能力;葉丹榕等（2014）研究皺紋盤鮑內(nèi)臟提取的粗多糖對小鼠的降血糖作用，發(fā)現(xiàn)其能夠提高糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然已有對鮑魚臟器粗多糖進(jìn)行層析和抗氧化活性的研究報(bào)道（鄒文文，2013），但其先以DEAE-52纖維素陰離子交換層析得到3個(gè)組分，再用葡聚糖凝膠G-100鑒定單一峰，且未進(jìn)行粗多糖和多糖的抗氧化能力比較;而本研究直接用葡聚糖凝膠G-100對鮑魚內(nèi)臟粗多糖（AVCP）進(jìn)行分離純化，并將粗多糖與其多糖的抗氧化能力進(jìn)行對比分析，找出其抗氧化優(yōu)勢組分。【擬解決的關(guān)鍵問題】將酶法提取的AVCP通過葡聚糖凝膠G-100柱層析分離純化，然后對分離純化后的AVP還原力、DPPH自由基清除率及羥自由基（OH自由基）清除率進(jìn)行測定，以抗壞血酸（Vc）為對比，評價(jià)AVP抗氧化能力，為鮑魚內(nèi)臟的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

鮑魚內(nèi)臟取自福建連江產(chǎn)雜交鮑，經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎混勻制成樣品，于-20 ℃下冷凍保藏。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、鄰二氮菲、Vc、硫酸亞鐵、Tris、過氧化氫、鹽酸和鄰苯三酚等均為國產(chǎn)分析純，購自廣州左克生物科技發(fā)展有限公司;試驗(yàn)用水為蒸餾水和超純水。主要儀器設(shè)備：HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、Sigam 3K30冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）、EYELA N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Eyela公司）、ALPHA 1-4冷凍干燥機(jī)（德國Christ公司）、Sunrise-basic Tecan吸光酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）、超聲波清洗儀（德國Elma公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 AVCP提取流程 鮑魚內(nèi)臟→凍干→粉碎過40目篩→鮑魚內(nèi)臟粉→調(diào)節(jié)料液比1∶49（g/mL，下同）→調(diào)節(jié)pH 8.6→胰蛋白酶加酶量2.1%→酶解溫度37 ℃，酶解時(shí)間2 h→沸水滅酶10 min→冷卻，調(diào)中性→離心（4500 r/min）10 min→加上清液3倍體積的95%乙醇→醇沉過夜→離心既得（陳勝軍等，2018）。

1. 2. 2 AVP分離純化流程 AVCP→去色素（丙酮、乙醇）→脫蛋白（胃蛋白酶解）→透析→反復(fù)凍融→冷凍干燥→初步純化的AVP→葡聚糖凝膠G-100柱層析→0.9%氯化鈉溶液洗脫→收集組分（AVP1和AVP2）。

1. 2. 3 脫蛋白 利用胃蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為料液比1∶40、加酶量0.2%、pH 3.0、溫度37 ℃、水解時(shí)間3 h，酶解工藝參考1.2.1，從而進(jìn)一步純化AVCP。

1. 2. 4 透析 將脫蛋白后的多糖配制成一定質(zhì)量濃度的多糖溶液，在截留分子量5000 Da的透析袋內(nèi)用超純水透析24 h，每隔3 h換一次水。

1. 2. 5 凍融 將透析后的多糖溶液保存在-20 ℃冷凍冰箱中24 h，取出后放置室溫緩慢融化，4 ℃高速（8000 r/min）離心20 min，除去沉淀。反復(fù)凍融多次，直到離心后無沉淀即可，取出溶液冷凍干燥后即為初步純化的AVP。

1. 2. 6 葡聚糖凝膠G-100柱層析 將初步純化的AVP配制成2 mg/mL多糖溶液，用葡聚糖凝膠G-100柱層析分離并收集，0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，流速0.5 mL/min，每6 min收集1管，共收集80管;用苯酚硫酸法檢驗(yàn)，得出洗脫峰。

1. 2. 7 DPPH自由基清除率測定 參考馬賽蕊等（2012）和陳義勇等（2013）的方法，取1.0 mL樣液，加入1.0 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液（用95%乙醇溶解），搖勻后室溫避光30 min，在517 nm波長處測定吸光值（Ai）;空白組為1.0 mL樣液加入1.0 mL 95%乙醇溶液混合，室溫避光30 min，在517 nm波長處測定吸光值（Aj）;對照組為1.0 mL DPPH溶液加入1.0 mL 95%乙醇，室溫避光30 min，在517 nm波長處測定吸光值（A0）。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）= [1-Ai-AjA0] ×100

1. 2. 8 OH自由基清除率測定 參考馬賽蕊等（2012）的方法，取0.3 mL鄰二氮菲·無水乙醇溶液，加入0.2 mL磷酸鹽緩沖液和0.3 mL硫酸亞鐵溶液，然后加入樣液1.0 mL混勻后，加入0.2 mL過氧化氫溶液搖勻，在37 ℃下水浴60 min，于510 nm波長處測其吸光值（AS）;以1.2 mL蒸餾水代替樣品和過氧化氫溶液進(jìn)行相同操作，測其吸光值（A0）;以1.0 mL蒸餾水代替樣品進(jìn)行相同操作，測其吸光值（Ad）。清除率按下式進(jìn)行計(jì)算：

OH自由基清除率（%）=[As-AdA0] ×100

注意操作中每加入一種試劑后要立即搖勻，否則會使局部顏色過深而影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，且過氧化氫最后加入。加樣情況如表1所示。

1. 2. 9 還原力測定 取樣液1.0 mL，加入1.0 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）和1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液混勻，在50 ℃水浴鍋內(nèi)保溫20 min，加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液，振蕩混勻后4 ℃下10000 r/mim離心10 min，吸取上清液1.0 mL，加入1.0 mL去離子水和0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液，振蕩混勻后50 ℃水浴保溫10 min，觀察溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色后，在700 nm波長處測其吸光值。以蒸餾水代替多糖樣品作為空白對照調(diào)零。

1. 2. 10 AVP抗氧化能力測定 將AVP分別配制成1、2、4、6、8和10 mg/mL溶液，通過測定AVP的DPPH自由基清除率、OH自由基清除率及還原力3個(gè)指標(biāo)，與對應(yīng)濃度相差100倍的Vc進(jìn)行對比，得出AVP的抗氧化能力。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析，運(yùn)用Design Expert 8.0.6對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 初步純化的AVP抗氧化活性

2. 1. 1 AVP的DPPH自由基清除能力 DPPH是一種很穩(wěn)定的自由基，由圖1可知，AVP質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL范圍內(nèi)，其對DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，通過擬合得出線性方程為y=9.715x+1.0182（R2=0.9958），計(jì)算得出AVP對DPPH自由基的半抑制濃度（IC50）為5.04 mg/mL;AVP對DPPH自由基具有清除作用，且10 mg/mL的清除率可達(dá)97.39%，但與Vc（圖2）相比，其對DPPH自由基清除能力仍較弱。

2. 1. 2 AVP的OH自由基清除能力 OH自由基是毒性最強(qiáng)的一種活性氧自由基，對生物機(jī)體具有很強(qiáng)的破壞作用。由圖3可知，AVP質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL范圍內(nèi)，其對OH自由基的清除率呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，通過擬合得出線性方程為y=6.2778x-8.5275（R2=0.9603），計(jì)算得出AVP對OH自由基的IC50為9.32 mg/mL;AVP對OH自由基具有清除作用，但與Vc（圖4）相比，其對OH自由基清除能力仍較弱。

2. 1. 3 AVP的還原能力 由圖5可知，AVP質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL范圍內(nèi)，其還原能力呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，通過擬合得出線性方程為y=0.0782x+0.0045（R2=0.9989）。以A700，0.2作為指標(biāo)比較還原能力，即A700為0.2時(shí)對應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度，由圖5和圖6可知AVP和Vc的A700，0.2分別為2.50和0.02 mg/mL，說明，AVP具有還原能力，但與Vc相比，其還原能力較弱。

2. 2 AVP1和AVP2的抗氧化活性

2. 2. 1 葡聚糖凝膠G-100柱層析結(jié)果 通過苯酚硫酸法測定吸光值得到洗脫曲線（圖7），從圖7可看出，AVP分離出兩個(gè)組分（AVP1和AVP2），收集峰高部分進(jìn)行抗氧化活性研究。

2. 2. 2 AVP1和AVP2的抗氧化活性 由表2可知，AVP1和AVP2的DPPH自由基清除率、OH自由基清除率和還原力3個(gè)指標(biāo)均高于AVP，可能是由于AVP中含有雜質(zhì)且不同組分間互相影響，而降低其抗氧化能力。AVP1和AVP2均具有一定的抗氧化活性，在前面試驗(yàn)中已知DPPH自由基清除率、OH自由基清除率和還原力3個(gè)指標(biāo)與多糖質(zhì)量濃度均呈線性關(guān)系，AVP1質(zhì)量濃度低于AVP2質(zhì)量濃度，但其DPPH自由基和OH自由基清除率均高于AVP2，還原力與AVP2接近，說明AVP1的抗氧化能力高于AVP2。

3 討論

多糖與機(jī)體生命的多種生理功能密切相關(guān)，具有多種生物活性功能。適量的自由基對細(xì)胞具有促進(jìn)分裂、生長及消炎等多種活性功能，但過多或清除過慢會使許多生物大分子受到攻擊，從而加速機(jī)體衰老（Guerra Dore et al.，2013;劉歡等，2018）。為了獲取天然安全的抗氧化物質(zhì)，王蒞莎等（2008）通過酶法提取鮑魚臟器多糖并進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)鮑魚臟器多糖具有一定的抗氧化能力，但未發(fā)現(xiàn)其哪一種組分更優(yōu);羅曉航（2012）對皺紋盤鮑臟器粗多糖的抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，鮑魚臟器粗多糖具有一定的抗氧化活性。本研究采用酶法提取并通過葡聚糖凝膠G-100柱層析分離純化出AVP，并對其還原力、DPPH自由基清除率及OH自由基清除率進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)AVP質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL內(nèi)對DPPH自由基和OH自由基的清除能力均呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，IC50分別為5.04和9.32 mg/mL;還原能力也呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，A700，0.2為2.50 mg/mL。通過3種指標(biāo)考察發(fā)現(xiàn)AVP具有一定的抗氧化能力，但與Vc相比，其抗氧化能力較弱。

葡聚糖凝膠G-100柱層析是通過分子量的大小進(jìn)行分離純化，其分離范圍為4000～150000 Da，本研究在透析時(shí)使用5000 Da的透析袋，因此選用G-100更有利于多糖組分的分離。AVP經(jīng)葡聚糖凝膠G-100柱層析可分離出兩個(gè)不同分子量的組分（AVP1和AVP2）;通過對3個(gè)抗氧化指標(biāo)的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AVP1和AVP2均具有一定的抗氧化能力，且AVP1的抗氧化能力高于AVP2，而兩個(gè)組分的抗氧化能力均高于AVP。這可能是由于粗多糖中AVP1和AVP2互相影響，或有其他物質(zhì)影響其抗氧化活性，導(dǎo)致AVP的抗氧化能力低于AVP1和AVP2。為了深入研究其抗氧化活性，下一步可對AVP1的結(jié)構(gòu)、性狀及作用機(jī)理進(jìn)行探究。

4 結(jié)論

通過葡聚糖凝膠柱層析可從AVP中有效分離出兩個(gè)組分（AVP1和AVP2），其中AVP1的抗氧化能力更強(qiáng)，在抗氧化添加劑及保健品等領(lǐng)域具有較好的開發(fā)利用前景。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）