鎘脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗生理特性和鎘富集的影響

閆志強(qiáng) 陳銀萍 蘧苗苗 等

摘?要：以“甘農(nóng)三號(hào)”紫花苜蓿幼苗為材料，在水培條件下，探究了在10 d內(nèi)不同濃度（0～2.0 mmol·L-1）鎘（Cd）脅迫對(duì)其根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、生物量、葉綠素和丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性、Cd富集及其亞細(xì)胞分布的影響。結(jié)果表明：低濃度（0.125 mmol·L-1）Cd能促進(jìn)幼苗根和莖的生長(zhǎng)，增加葉片葉綠素含量，較高濃度（0.5～2.0 mmol·L-1）Cd顯著抑制幼苗根和莖的生長(zhǎng)，葉綠素及生物量顯著降低;Cd脅迫使MDA含量顯著增加，而SOD和POD活性顯著增強(qiáng)，其中Cd脅迫濃度為0.5 mmol·L-1時(shí)，SOD和POD活性達(dá)到最大值，這可能是植物對(duì)環(huán)境脅迫的一種應(yīng)激保護(hù)反應(yīng);Cd在各亞細(xì)胞組分中的含量依次為細(xì)胞壁>細(xì)胞質(zhì)>線粒體>葉綠體，且均隨Cd脅迫濃度的升高而增加。當(dāng)Cd脅迫濃度為0.125 mmol·L-1時(shí)，水培10 d的紫花苜蓿幼苗單株地上部對(duì)Cd的凈化率最高可達(dá)0.214%，而整盆植株在單位體積內(nèi)對(duì)Cd的凈化率最高可達(dá)15.5%;當(dāng)Cd脅迫濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿幼苗地上部Cd含量達(dá)89.36 μg·g-1。這些結(jié)果表明紫花苜蓿對(duì)Cd具有很強(qiáng)的富集能力，雖未達(dá)到Cd超富集植物的臨界標(biāo)準(zhǔn)，但從植株生物量、耐Cd能力、富集Cd量及對(duì)Cd的凈化率等方面綜合考慮，紫花苜蓿在Cd污染土壤的植物修復(fù)中具備良好的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：鎘脅迫，紫花苜蓿，生理特性，鎘富集，鎘污染

Abstract：Taking seedlings of alfalfa variety ‘Medicago sativa cv. Gannong No. 3’，we studied the effects of Cd stress on the length of stem and root，biomass，the contents of chlorophyll and malonyldialdehyde （MDA），the activities of superoxide dismutase （SOD） and peroxide enzyme （POD），Cd enrichment and Cd subcellular distribution in leaf of alfalfa seedlings under Cd stress with concentration between 0 to 20 mol·L-1 for 10 d. The results showed that length of stem and root，chlorophyll content increased under lower Cd concentration （0.125 mmol·L-1） stress. However，lower length of stem and root，biomass and chlorophyll content were observed under the higher Cd concentration （0.5～2.0 mmol·L-1） stress. Accumulation of reactive oxygen species（ROS） in alfalfa seedlings under Cd stress caused membrane lipid system peroxidation，MDA content increased significantly，while the activity of SOD and POD was significantly enhanced. When the concentration of Cd stress was 0.5 mmol·L-1，the activity of SOD and POD reached the maximum，which may be a protective reaction of plants to environmental stress，antioxidant enzyme system was started up to remove ROS accumulated during Cd stress and to mitigate membrane lipid peroxidation damage caused by Cd stress. Subcellular distribution of Cd in leaf was in the order of cell wall，cytoplasm，mitochondria，chloroplast，and the content of Cd in each subcellular fraction increased with the concentration increase of Cd stress. When the concentration of Cd was 0.125 mmol·L-1，purification rate of Cd in the shoots of individual plants grown in nutrient solution for 10 d up to 0.214%，and the purification rate of Cd for whole pot plant per unit volume up to 15.5%. When the concentration of Cd was 2.0 mmol·L-1，the content of Cd in the aboveground part of alfalfa seedlings was 89.36 μg·g-1. Those results suggest that alfalfa has a very strong enrichment ability for Cd，although it does not meet the critical criteria for Cd-rich plants. However，alfalfa has a good application value in the phytoremediation of Cd-contaminated soil，considering the plant biomass，Cd tolerance，Cd enrichment，and purification rate of Cd.

Key words：Cd stress，alfalfa，physiological characteristics，Cd enrichment，Cd pollution

鎘（cadmium，Cd）以硫鎘礦的形式存在自然界中，近年來(lái)，隨著采礦、電鍍、冶金等工業(yè)活動(dòng)產(chǎn)生的“三廢”排放，導(dǎo)致大量Cd進(jìn)入自然環(huán)境，大面積土壤被污染，形勢(shì)十分嚴(yán)峻（Hawrylak et al.，2014;Reiser et al.，2014;陳永勤等，2015）。Cd具有毒性大、容易轉(zhuǎn)移、降解困難且分解周期極長(zhǎng)等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被農(nóng)作物吸收后，除了會(huì)破壞植物的生理活動(dòng)，導(dǎo)致其產(chǎn)量和質(zhì)量低下外，還會(huì)被人攝取危害健康（李婧等，2015;申強(qiáng)等，2015）。所以，Cd污染土壤的修復(fù)已成為土壤學(xué)、生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

利用超富集植物吸附重金屬的特性修復(fù)Cd污染土壤的方法，由于其操作簡(jiǎn)單便捷、費(fèi)用少、環(huán)境友好、且可大規(guī)模實(shí)施等優(yōu)點(diǎn)而日益受到世界研究者的重視（馬彩云等，2013）。然而在自然界中具有超富集特性的植物類別很少，多數(shù)生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量低，而且只在少數(shù)地區(qū)分布。因此，從超富集植物資源中篩選生長(zhǎng)迅速且產(chǎn)量高的植物成為植物修復(fù)技術(shù)的一條新思路。紫花苜蓿（Medicago sativa）是全球范圍內(nèi)普遍種植的草本植物，其生長(zhǎng)快、適應(yīng)能力好、根系發(fā)達(dá)、枝葉繁多、生物學(xué)產(chǎn)量高，在牧草業(yè)被認(rèn)為是牧草之最（徐蘇凌等，2008;陳銀萍等，2015）。已有報(bào)道顯示土壤中Cu、Zn等重金屬可以被紫花苜蓿吸收富集（蘧苗苗等，2016;王文星等，2006;代惠萍等，2014;劉菊梅等，2018）。目前，關(guān)于紫花苜蓿的報(bào)道多數(shù)集中在對(duì)鹽和干旱脅迫的響應(yīng)（李文嬈等，2010;張立全等，2012）以及重金屬脅迫下種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)及生理特性等方面（曹婷和代惠萍，2014;蘧苗苗等，2016），而紫花苜蓿對(duì)重金屬Cd富集特性和Cd污染土壤修復(fù)的研究則比較缺乏。

Cd脅迫能引起植株的生理生化產(chǎn)生一系列的變化。長(zhǎng)期Cd脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）累積，進(jìn)一步引起氧化脅迫，使植物根系活力下降，植物生長(zhǎng)受抑制，葉綠素分解，植物葉片發(fā)黃干枯等（Smeets et al.，2005;王松華等，2011;尹國(guó)麗等，2013）。而抗氧化系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，減少對(duì)植物造成的損害（Francisco & José，2011;江玲等，2014）。本研究以紫花苜蓿幼苗為材料，分析了不同濃度Cd脅迫下紫花苜蓿幼苗的生物量、光合色素、膜脂過(guò)氧化、抗氧化及Cd累積特性，探究紫花苜蓿在鎘脅迫下的生長(zhǎng)情況以及對(duì)Cd的積累，以期為闡明紫花苜蓿受鎘毒害的機(jī)制與修復(fù)鎘污染土壤給出指導(dǎo)。

1?材料與方法

1.1 材料和試劑

以“甘農(nóng)三號(hào)”（Gannong No.3）紫花苜蓿作為實(shí)驗(yàn)材料，選購(gòu)于甘肅農(nóng)科院。Cd脅迫用5/2水合氯化鎘（國(guó)藥試劑），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

挑選大小均一的紫花苜蓿種子，為提高其發(fā)芽率，將種子置于溫蒸餾水（50～60 ℃）中0.5 h。種子取出晾干后播種在含有1/2濃度Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液的生長(zhǎng)介質(zhì)中，于室內(nèi)培養(yǎng)架中發(fā)芽生長(zhǎng)，共24盆，定期更換生長(zhǎng)介質(zhì)。培養(yǎng)30 d左右，待幼苗長(zhǎng)出約3片葉時(shí)，挑選大小相似的21盆，分成7組，Cd脅迫試劑為CdCl2，Cd濃度梯度為0（CK）、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol·L-1，繼續(xù)水培3 d后（水培體積為500 mL），分別對(duì)根、莖和葉進(jìn)行混合取樣，鮮樣測(cè)定葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素（Car）、丙二醛（MDA）含量及過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和Cd的亞細(xì)胞分布。水培10 d后進(jìn)行終期采樣，測(cè)量根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)，根、莖和葉的鮮重及干重，測(cè)定重金屬Cd含量。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 生理生化指標(biāo)?采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量（趙世杰等，2002）;丙酮提取法測(cè)定葉綠素含量（張志良和翟偉菁，2004）;氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測(cè)定SOD活性（李合生，2000）;愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定POD活性（李合生，2000）。

1.3.2 重金屬Cd含量測(cè)定?分別對(duì)根、莖和葉進(jìn)行混合取樣，粉碎過(guò)0.425 mm篩。稱取樣品2.0 g放入消解管中，濃硝酸和高氯酸分別添加20 mL和4 mL，然后低溫?zé)徜N解。當(dāng)溶液到4 mL左右時(shí)，添加10 mL超純水，繼續(xù)消解13 min左右，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，冷卻至室溫，以0.2%的硝酸定容，使用原子吸收分光光度計(jì)（美220FS）分析其中Cd含量（鮑士旦，2007），并計(jì)算Cd轉(zhuǎn)運(yùn)速率、吸收速率和單株地上部對(duì)Cd的凈化率（冉烈等，2012）。

Cd轉(zhuǎn)運(yùn)速率=單株地上部富集Cd量/根系干重/10 d;Cd吸收速率=單株富集Cd量/根系干重/10 d;10 d內(nèi)單株地上部對(duì)Cd的凈化率=單株地上部富集Cd的量/水中全Cd量×100%;10 d內(nèi)整盆植株在單位體積內(nèi)對(duì)Cd的凈化率=整盆植株富集Cd的量/水中全Cd量/水培體積×100%，其中，水中全Cd量=水培盆中水的體積×Cd濃度。

1.3.3 Cd的亞細(xì)胞分布?取嫩葉1 g，置于10 mL預(yù)冷的勻漿液中研磨勻漿。勻漿液組成：250 mmol·L-1 蔗糖，50 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4），1 mmol·L-1 二硫赤蘚糖醇（C4H10O2S2）。勻漿后，進(jìn)行差速離心，依次為600 r·min-1 下10 min沉淀為細(xì)胞壁，1 000 r·min-1 下15 min沉淀為葉綠體以及10 000 r·min-1下20 min沉淀為線粒體，上層溶液為胞質(zhì)組分（含液泡，核糖等），每次離心重復(fù)進(jìn)行3次（湯惠華等，2008）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算均值，方差等和制圖。用SPSS 22.0軟件進(jìn)行組間單因素方差分析，多重比較采用Duncan法（α=0.05）。

2?結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和生物量的影響

紫花苜蓿幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)隨著Cd濃度的增大均先增加后減小。0.125 mmol·L-1 Cd處理使莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)顯著增加（P<0.05），與CK相比分別增加了7.35%和11.00%。隨著Cd濃度的進(jìn)一步增大，莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)依次減小，2.0 mmol·L-1 Cd處理分別比CK減少了47.47%和58.18%（P<0.05）（圖1：A）。Cd脅迫下紫花苜蓿幼苗的干重與CK相比無(wú)顯著差異，但Cd脅迫使幼苗的鮮重和含水量顯著降低（P<0.05），降低幅度隨Cd脅迫濃度的加大而增大。2.0 mmol·L-1 Cd處理后的幼苗鮮重和含水量分別比CK下降59.91%和24.1%（圖1：B）。

2.2 Cd脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片中葉綠素與類胡蘿卜素含量的影響

Cd濃度為0.125 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿幼苗葉中葉綠素a、葉綠素b和Car含量與CK相比無(wú)顯著差異（P>0.05），而隨著Cd處理濃度增加，葉綠素a、葉綠素b和Car含量明顯下降，其中在Cd濃度為2.0 mmol·L-1降至最低，分別僅為CK的47.01%、72.27%和51.28%（P<0.05）。葉綠素a/b值隨Cd處理濃度的增加持續(xù)下降（表1）。

2.3 Cd脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗MDA含量與抗氧化酶的影響

紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的MDA含量經(jīng)不同濃度Cd處理后顯著提高（P<0.05），其中，在Cd處理濃隨著Cd處理濃度的增大，紫花苜蓿根、莖和葉中SOD活性總體呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。其中，當(dāng)Cd處理濃度為0.125 mmol·L-1時(shí)，莖中的SOD活性略大于根和葉中，但相較于CK，根中SOD活性顯著降低（P<0.05），而莖和葉中的SOD活性則略微升高（P>0.05）。而Cd處理濃度為0.5 mmol·L-1時(shí)根和莖中SOD活性達(dá)最強(qiáng)，Cd處理為0.25 mmol·L-1時(shí)葉中SOD活性達(dá)最強(qiáng)，與CK相比分別增強(qiáng)了55.27%、45.90%、100.28%（P<0.05）;而Cd處理為2.0 mmol·L-1時(shí)，莖、葉中SOD活性被顯著抑制（P<0.05），根中則與CK大致持平（P>0.05）（圖3：A）。紫花苜蓿幼苗根、莖和葉中POD的活性在Cd處理濃度為0.125 mmol·L-1時(shí)均顯著高于CK，其中根中的POD活性顯著高于莖和葉中的活性（P<0.05）。繼續(xù)增加Cd處理濃度，POD變化趨勢(shì)與SOD大致相似，0.5、1.0、0.25 mmol·L-1 Cd處理分別使根、莖、葉中POD達(dá)最強(qiáng)，對(duì)比CK分別增強(qiáng)了71.75%、96.60%、54.13%（P<0.05）;而隨著Cd濃度進(jìn)一步增大，根、莖和葉中POD活性雖較最大值有所減少，但仍顯著高于CK（P<0.05）（圖3：B）。

2.4 Cd在紫花苜蓿幼苗葉片內(nèi)的亞細(xì)胞分布

紫花苜蓿葉片亞細(xì)胞組分內(nèi)Cd的含量大小不一，而細(xì)胞壁內(nèi)的Cd含量最高，占總量的53.71%～61.85%;其次為細(xì)胞質(zhì)，占總量的19.51%～31.68%;再次是線粒體，占總量的8.85%～17.07%;而葉綠體中Cd含量較少，僅占總量的2.44%～7.87%。葉片各亞細(xì)胞組分Cd含量隨Cd濃度升高而顯著增加（P<0.05）。對(duì)比CK，葉片內(nèi)的全Cd量增加了43.17倍，而細(xì)胞壁、葉綠體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中Cd含量與CK相比最大增加的倍數(shù)分別為38.03、100.52、22.75、69.97（P<0.05）（表2）。

2.5 紫花苜蓿幼苗對(duì)Cd的積累和轉(zhuǎn)運(yùn)

不同濃度Cd處理后，紫花苜蓿地上部（莖、葉）與地下部（根）均在不同程度上積累了Cd。隨著Cd處理濃度的增大，其積累量顯著增加（P<0.05）。當(dāng)Cd處理濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿積累Cd量達(dá)最高，而隨著Cd處理濃度的增加，10 d內(nèi)單株地上部對(duì)Cd的凈化率及整盆植株在單位體積內(nèi)對(duì)Cd的凈化率則依次降低，其中濃度為0.125 mmol·L-1的Cd處理時(shí)凈化率最高，相當(dāng)于平均每株從水中帶走的Cd占水中全Cd含量的0.214%，每盆中全部植株從單位體積的Cd溶液中吸收的Cd占水中全Cd含量的15.5%。而紫花苜蓿體內(nèi)Cd的吸收速率和轉(zhuǎn)運(yùn)速率則隨著Cd處理濃度的增大呈現(xiàn)依次增高的趨勢(shì)，在Cd處理濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)達(dá)最高值，分別為8.774和16.190 μmol·g-1·d-1（表3）。

3?討論與結(jié)論

重金屬的積累會(huì)影響植物的正常生理過(guò)程，抑制植株生長(zhǎng)，使生物量降低（徐蘇凌等，2008）。

一般認(rèn)為，低濃度Cd能刺激種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)而較高濃度的Cd則對(duì)其有抑制的效應(yīng)（張春容等，2004）。本研究中，0.125 mmol·L-1 Cd處理使莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)顯著增加，而隨著Cd濃度的進(jìn)一步增大，莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)依次減小，導(dǎo)致植株明顯低矮。同時(shí)，Cd脅迫下植株幼苗的干重與CK無(wú)顯著差異，而鮮重和含水量隨Cd濃度增大而顯著降低，其中2.0 mmol·L-1 Cd處理使植株鮮重和含水量降至最低。由于植物體內(nèi)的絕大多數(shù)代謝活動(dòng)都是在水介質(zhì)中進(jìn)行的，而且水分也是某些植物代謝過(guò)程中重要的反應(yīng)物質(zhì)，所以含水量減少影響了紫花苜蓿幼苗正常的生理代謝，導(dǎo)致幼苗干枯。這與Adamakis et al.（2014）研究結(jié)果相同，進(jìn)一步證明植物過(guò)量吸收Cd會(huì)影響其正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

光合作用是植物轉(zhuǎn)化光能為化學(xué)能的基礎(chǔ)生理活動(dòng)，葉綠素作為光合作用的關(guān)鍵色素，其含量多少標(biāo)志著植物生長(zhǎng)能力的強(qiáng)弱（湯惠華等，2008）。本研究中，紫花苜蓿幼苗葉片中葉綠素含量與其根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)的變化趨勢(shì)相似，低濃度Cd處理使葉中葉綠素a、葉綠素b和Car含量較CK均有所增加，但繼續(xù)升高Cd的濃度時(shí)，葉綠素a、葉綠素b和Car的含量則顯著減少，這與湯惠華等（2008）的研究結(jié)果一致。Cd被植物吸收固定時(shí)引起ROS大量積累（生吉萍等，2009），ROS能抑制葉綠素和Car合成相關(guān)酶的活性以及加速葉綠素和Car的降解，從而使葉綠素與Car含量降低。葉綠素a、葉綠素b都能夠捕獲和傳遞光能，但只有少數(shù)特殊狀態(tài)下的葉綠素a具有將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能的功能（孫小玲等，2010），本研究中Cd處理使葉綠素a/b值降低，說(shuō)明Cd對(duì)葉綠素a的影響大于葉綠素b，本實(shí)驗(yàn)在光照充足的條件下進(jìn)行，葉綠素a含量的變化更能影響紫花苜蓿的光合作用。Car行使光能捕獲和光破壞防御功能（孫小玲等，2010），Cd脅迫下Car含量降低，導(dǎo)致紫花苜蓿幼苗捕獲光能不足而影響光合效率，抵御光氧化傷害的能力減弱而損傷光合機(jī)構(gòu)（Demmig-Adams & Adams，2000;Matsubara et al.，2008），這進(jìn)一步說(shuō)明Cd脅迫能導(dǎo)致紫花苜蓿幼苗光合作用減弱并抑制其生長(zhǎng)。

與項(xiàng)目組前期研究結(jié)果一致（蘧苗苗等，2016），本研究中，紫花苜蓿根、莖、葉中MDA含量均隨Cd濃度的升高而增加，且顯著高于CK，而其抗氧化酶系統(tǒng)中的SOD與POD活性則整體呈現(xiàn)先升高再隨Cd處理濃度增大而降低的趨勢(shì)。其中，在低濃度Cd脅迫（0.125 mmol·L-1）下，根中MDA顯著高于莖和葉，說(shuō)明直接接觸Cd脅迫的根組織與莖和葉相比，細(xì)胞膜受損更嚴(yán)重;根中的SOD活性則顯著低于CK，莖和葉中的SOD活性與CK無(wú)顯著差異，說(shuō)明低濃度Cd脅迫抑制了根中SOD的活性，而根、莖、葉中POD的活性均顯著高于CK，說(shuō)明紫花苜蓿在受到低濃度Cd脅迫時(shí)，POD能被激活以及時(shí)清除ROS;根中的POD活性顯著高于莖和葉中的活性，說(shuō)明低濃度Cd脅迫下與Cd直接接觸的根部組織中POD活性變化更為迅速和激烈。在高濃度（1.5～2.0 mmol·L-1）Cd脅迫下，根中POD和SOD活性雖較最大值有所下降，但仍顯著高于CK，特別是根中的SOD被顯著激活，協(xié)同POD清除根中ROS，減輕高濃度Cd造成的膜脂過(guò)氧化損傷，相應(yīng)的根中MDA含量則顯著下降，說(shuō)明植物抵抗Cd脅迫過(guò)程中抗氧化酶系統(tǒng)的各種酶是相互協(xié)調(diào)配合起作用，而不只是由于某個(gè)酶的活性變化就可以起到抗氧化效果（高福元等，2010）;雖然莖中SOD活性低于根和葉，但POD活性居中，可以清除部分ROS，而且，由于莖中的細(xì)胞壁果膠和半纖維含量較高，使Cd沉積在細(xì)胞壁中解毒，大大緩解了Cd對(duì)莖的毒害作用，從而使MDA含量低于根和葉（周翠等，2017）;而葉中MDA含量顯著高于根和莖，導(dǎo)致膜的損傷和破壞，造成葉片內(nèi)重要的活性氧清除酶SOD 和POD活性降低，特別是POD活性，表明高度積累的MDA 對(duì)于 SOD 和POD的活性起抑制作用（朱涵毅等，2013）。說(shuō)明Cd在同一植株的不同部位導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化程度不同，而且抗氧化酶在同一植株不同部位以及不同濃度Cd脅迫下被激活的速度與程度也有差別，這種差異可能與植物的器官及酶的種類有關(guān)（尹國(guó)麗等，2013）。

植物可通過(guò)調(diào)整 Cd在亞細(xì)胞組分中的分配實(shí)現(xiàn)對(duì)Cd毒害的適應(yīng)（湯惠華等，2008）。本研究中，Cd在各組分中的含量分配排序?yàn)榧?xì)胞壁>細(xì)胞質(zhì)>線粒體>葉綠體。這與Wang et al.（2008）研究結(jié)果一致。表明Cd大部分分布于細(xì)胞壁中，細(xì)胞壁中的多糖分子和蛋白質(zhì)分子能結(jié)合Cd2+，使Cd沉淀在細(xì)胞壁中，阻擋一些Cd進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而降低Cd對(duì)植物造成的毒害（Kupper et al.，2000;李紅婷和董然，2015）。高濃度Cd脅迫下葉綠體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Cd含量分配增加，細(xì)胞壁和線粒體內(nèi)的Cd含量分配減少。說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞壁對(duì)Cd的滯留作用減弱，更多的Cd進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并產(chǎn)生影響，本研究中，葉片各亞細(xì)胞組分Cd含量隨著Cd濃度的升高均顯著增加，而與CK比較，葉綠體增加的倍數(shù)最大（100.52倍）。作為植物細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵細(xì)胞器，葉綠體和線粒體代謝活躍，功能性強(qiáng)，特別是對(duì)于葉綠體來(lái)說(shuō)，Cd含量的激增能破壞類囊體，甚至于破壞雙層膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致葉綠體基質(zhì)外流和解體（吳建慧等，2016），且光合作用相關(guān)的色素位于類囊體膜的蛋白質(zhì)復(fù)合體中（孫小玲等，2010），所以，過(guò)量的Cd進(jìn)入葉綠體中會(huì)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞作用。與此同時(shí)，如前所述，Cd脅迫下大量積累的ROS使葉綠素和Car合成酶活性受到抑制，葉綠素和Car的降解加速，導(dǎo)致葉綠素與Car含量降低，這進(jìn)一步加深了Cd對(duì)紫花苜蓿幼苗的毒害作用。有研究表明（Allan & Jarrell，1989）當(dāng)細(xì)胞壁對(duì)Cd的貯藏能力達(dá)到飽和時(shí)，Cd會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞中代謝不活躍區(qū)域，且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的部分小分子化合物能結(jié)合Cd形成沉淀，對(duì)Cd具有一定的耐受性。因此，盡管Cd在葉綠體中的含量很少，但對(duì)比CK卻是成倍激增，相比細(xì)胞中的其他組分受到的損傷卻是最嚴(yán)重的。

紫花苜蓿地上部和地下部的Cd含量、Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)速率伴隨Cd脅迫濃度的增加均顯著升高，表明在本研究的濃度梯度內(nèi)，紫花苜蓿吸附積累Cd離子的量隨著脅迫濃度增大而逐漸增加，對(duì)Cd的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)速率也持續(xù)增大，過(guò)量Cd積累導(dǎo)致植株進(jìn)一步受到損傷。而低濃度下，地下部的Cd含量始終高于地上部的，這是由于根部最先接觸Cd脅迫，交換吸附的量比較多，而這與Kupper et al.（2000）的研究結(jié)果一致;而只有少量的Cd離子經(jīng)過(guò)根部后運(yùn)輸?shù)搅饲o和葉，故紫花苜蓿地上部的Cd含量相對(duì)較低。在1.0 mmol·L-1 Cd脅迫之后，地下部的Cd離子的吸附量已近飽和，植株對(duì)Cd的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)速率趨于平緩，紫花苜蓿幼苗出現(xiàn)葉片枯黃萎縮的現(xiàn)象，部分幼苗已接近死亡，說(shuō)明此時(shí)紫花苜蓿吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)Cd離子的量已經(jīng)接近極限，嚴(yán)重影響了紫花苜蓿體內(nèi)各種生理代謝。Baker & Brooks（1989）認(rèn)為地上部對(duì)Cd富集達(dá)100 μg·g-1為Cd超富集植物的臨界標(biāo)準(zhǔn)含量，另外還需具備較好的生長(zhǎng)抗性。在本研究中，當(dāng)Cd處理濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿幼苗地上部Cd含量達(dá)89.36 μg·g-1;Cd處理濃度為0.125 mmol·L-1時(shí)，10 d內(nèi)紫花苜蓿幼苗單株地上部對(duì)Cd的凈化率最高，達(dá)到 0.214%。本研究中，培養(yǎng)10 d的紫花苜蓿雖未達(dá)到Cd超富集植物的臨界標(biāo)準(zhǔn)，但紫花苜蓿對(duì)Cd的富集量為89.36 μg·g-1，與相關(guān)研究中培養(yǎng)105 d的苦草（Vallisneria natans）對(duì)Cd的富集量為90 mg·kg-1（喬云蕾等，2016）相似;單株地上部對(duì)Cd的最大凈化率為0.214%，與芥菜型油菜（Brassica juncea）培養(yǎng)30 d對(duì)Cr的凈化率為0.23%（王愛(ài)云等，2011）及培養(yǎng)66 d對(duì)Zn和Cd的凈化率分別為0.29%和0.13% （蔣先軍等，2002）相似。因此，從植株富集Cd量，耐Cd程度及對(duì)Cd的凈化率等方面對(duì)比考慮，紫花苜蓿在Cd污染土壤的植物修復(fù)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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